В Vivo Функциональное мозга изображений подход, основанный на Биолюминесцентный кальция Индикатор GFP-акворина
8 января 2016 г.
Здесь мы представляем роман Ca 2+ -imaging подход с использованием биолюминесцентного репортера. Этот подход использует конденсированную конструкт GFP-экворин, который связывается с Са 2+ и излучает свет, устраняя необходимость в возбуждении светом. Значительно этот метод позволяет длительной непрерывной визуализации, доступ к глубинных структур головного мозга и высоким временным разрешением.
Общая цель биолюминесцентной визуализации заключается в том, чтобы визуализировать in vivo функциональный кальциевый транзиент, показатель активности, в течение более длительных периодов времени и в глубоких структурах мозга. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, например, как выглядит базальная активность мозга мухи во время сна. Главное преимущество этой методики заключается в том, что она не требует возбуждения с помощью лазера.
Это позволяет визуализировать переходный кальций глубже в ткани и в течение более длительного периода времени без фотообесцвечивания и токсичности, по сравнению с классической визуализацией кальция. Этот метод может дать представление о базальной активности мозга у дрозофил, а также может быть использован с другими модельными организмами, такими как мышь. Для начала подготовьте интересующую вас линию drosophila melanogaster и экспериментальные решения, как описано в сопроводительном текстовом протоколе.
Затем ледом обезболите одну дрозофилу, перенеся ее в стеклянный флакон со льдом на две минуты. Затем переместите муху в охлажденную чашку Петри и с помощью щипцов аккуратно поместите муху внутрь наконечника пипетки объемом 1000 микролитров, обрезанного так, чтобы кончик находился под углом примерно 35 градусов. С помощью щетки аккуратно надавите и выровняйте каждую муху так, чтобы голова полностью находилась за краем кончика, а спинная область была частично обнажена.
Затем нанесите приготовленный стоматологический клей с головки на край кончика пипетки. Будьте особенно осторожны, чтобы не повредить макушку. Склеивание головы имеет решающее значение, потому что ее фиксация в правильном положении имеет важное значение для успешного вскрытия и визуализации.
Кроме того, плохое склеивание приведет к утечке раствора кольца и гибели образца до начала визуализации. Затем поместите наконечник пипетки с прикрепленной к нему ширинкой в отверстие в записывающей камере и осторожно нажмите, чтобы закрепить его на месте. Затем с помощью подготовленного силиконового клея закрепите плоскую сторону камеры в месте ее соприкосновения с наконечником пипетки, чтобы предотвратить утечки.
Приложите штучок крана к каналу для обильности, короткому краю и продолжающемуся к задней части патронника. Далее поместите камеру с мухой под микроскоп и включите люминесцентную лампу. Затем пипеткой нанесите в камеру один миллилитр раствора рингера.
С помощью тонкого хирургического ножа сделайте параллельные разрезы от затылка головы мухи до передней области с обеих сторон. Затем разрежьте по краю глаза, и сделайте перпендикулярный разрез над антенной, которая соединяет предыдущие разрезы. Сделайте окончательный разрез на затылке, а затем с помощью пары тонких острых щипцов удалите кутикулу.
Аккуратно захватите и удалите все открытые дыхательные ткани, пока мозг и тело флуоресцентного гриба не станут четко визуализированы. Затем с помощью ультраострых щипцов тщательно захватите и защемите ткань нервного эпителия, покрывающую мозг, чтобы удалить ее и обеспечить проникновение целэнтеразина. С помощью пипетки дважды промойте ткань одним миллилитром раствора Рингера, чтобы удалить любой мусор, оставшийся после вскрытия, а затем поместите образец в темную коробку.
Далее пипеткой в камеру впрыскивается один миллилитр раствора Рингера, содержащего пять микромоляров бензил-целэнтеразина. Закройте коробку и инкубируйте образец при комнатной температуре не менее двух часов. Начните с включения микроскопа в компьютере.
Также охладите камеру до отрицательных 80 градусов по Цельсию. Затем настройте дренажную систему и отрегулируйте контроль окружающей среды на 20 градусов по Цельсию. Затем откройте фотонный имидж-сканер, создайте новую папку и назовите первую запись.
Затем настройте систему изобилия, добавив хлорид калия, никотин и раствор рингера в соответствующие резервуары. Отрегулируйте расход так, чтобы каждый раствор выделялся со скоростью два миллилитра в минуту. Далее поместите образец на крепление под микроскопом, и отрегулируйте увеличение до 5Х.
Затем вставьте профузионную трубку в канал через прокол. Установите микроскоп в режим флуоресценции, а затем центрируйте и сфокусируйте тела грибов. Как только тела грибов окажутся в фокусе, измените увеличение на 20X.
Отцентрируйте изображение по центру и отрегулируйте фокус. Затем расположите дренажный аппарат над дренажным бассейном и отрегулируйте высоту дренажного шунта так, чтобы наконечник находился чуть выше дренажного бассейна. Затем промойте образец раствором рингера в течение 30 секунд, чтобы проверить достаточный дренаж.
Наконец, потяните щиток вниз, чтобы изолировать устройство от любого внешнего света. С помощью автоматизированной системы в программе фотонный формирователь изображения внесите тонкие корректировки в фокус, и сделайте эталонное флуоресцентное изображение тел грибов. Отрегулируйте скорость фотонов до желаемой скорости записи, которая должна составлять от одного изображения каждые 50 миллисекунд до одного изображения в секунду или более.
Затем выберите фотонный режим и откройте затвор. Далее введите генотип, пол, возраст и номер образца в записи журнала. Отрегулируйте положение прямоугольников области интереса над чашечкой, телами клеток и медиальными лепестками, щелкнув по квадратикам и перетащив их в нужное положение, удерживая контроль.
Теперь запишите базовые значения в течение примерно 5–10 минут. Далее нажмите на выключатель, чтобы начать поступление никотина. В то же время нажмите Enter и добавьте примечание, обозначающее, что поток никотина начался.
Через минуту остановите поток и сделайте еще одну отметку в журнале, означающую, что поток был остановлен. Затем промойте образец раствором рингера в течение пяти минут. Пока образец восстанавливается, выключите промывку, установите таймер еще на пять минут и приготовьтесь к запуску потока хлористого калия.
Когда все будет готово, запустите поток хлорида калия и введите 100 миллимолярных значений хлорида калия в журнал отбора проб. Через одну минуту остановите поток и введите отрезанный хлористый калий в журнал отбора проб. Затем промойте образец раствором Рингера в течение одной минуты и переключите микроскоп в флуоресцентный режим.
Сделайте окончательное флуоресцентное изображение, а затем выключите раствор для звонка и удалите образец. В программе анализа откройте первый файл, выберите вкладку «Управление отображением» и нажмите на ROI. Затем, удерживая клавишу Control, выберите интересующую область.
Затем отрегулируйте размер, ориентацию и форму ROI, чтобы охватить освещенные GFP чашечки и тела клеток, а также медиальные доли. После того, как все интересующие регионы будут добавлены, выберите вкладку «фильм» для воспроизведения фотонного видео. Отрегулируйте вторую ширину и вторые ступени по желанию.
Затем при необходимости измените расположение ROI, чтобы он оставался в активных областях видео. Выберите несколько репрезентативных скриншотов флуоресценции GFP, никотиновой реакции и реакции хлорида калия. Затем обрежьте скриншоты и вставьте репрезентативные изображения в слайд презентации для последующего анализа и сравнения.
Отрегулируйте вторую ширину и второй шаг в соответствии со скоростью записи за секунды. Кроме того, выберите продолжительность анализа, переместив серые маркеры на верхней панели в область за скобками, до инициирования стимула и сразу после окончания ответа. Затем выберите «Приостановить просмотры» во время воспроизведения, а затем нажмите кнопку перемотки, чтобы сбросить воспроизведение видео до начала, а затем кнопку воспроизведения.
Затем выберите вкладку "График скорости подсчета", чтобы настроить единицы измерения, а также настроить цвет интересующих областей, а также цвета линий по желанию. Когда анализ будет завершен, выберите экспорт данных о скорости подсчета. Затем выберите объединенные записи тел чашечки и клеток, а также из областей медиальной доли с каждой стороны и вставьте эти изображения на слайд с изображениями ответа.
Одним из самых простых способов стимуляции грибных тел является активация ионотропных никотиновых ацетилхолиновых рецепторов. Типичная реакция на 25 микромолярный никотин, показанная здесь, начинается с быстрой активации как чашечки и клеточных тел, так и медиальных долей, и использует слитую конструкцию GFP-экворина, которая связывается с кальцием и излучает свет. Как правило, реакция в чашечке и телах клеток длится дольше и проявляет большую биолюминесцентную реакцию, чем доли, как показано на последовательных панелях реакции.
Пример записи биолюминесцентного ответа на никотиновую активацию с течением времени описывается этим графиком, где количество фотонов в интересующей области, содержащей чашечку и тела клеток, обозначено черным цветом, а количество фотонов в области медиальной доли показано красным цветом. По этому графику можно определить длину отклика, пиковое значение фотона во время отклика и общую площадь под каждой кривой. После освоения фаза подготовки должна занять всего два часа до инкубации, в зависимости от количества мух.
Кроме того, каждая запись может быть завершена всего за двадцать минут, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о правильном старении и хранении нахлыстового стада, чтобы обеспечить воспроизводимость образцов. После этой процедуры могут быть проведены дальнейшие поведенческие тесты, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, какое влияние оказывает активность структуры на конкретное поведение.
Разработка этого метода проложила путь исследователям в области нейробиологии к изучению долгосрочной нейронной активности в мозге дрозофилы. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как готовить образцы для биолюминесцентной визуализации в мозге мухи. Не забывайте, что никотин может быть опасен для вашего здоровья.
Следует соблюдать меры предосторожности, такие как перчатки, при приготовлении растворов или уборке после этой процедуры.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлена новая методика биолюминесцентной визуализации для функциональной регистрации транзиентов кальция in vivo. Метод основан на использовании конструкции GFP-aequorin, которая связывает Ca2+ и испускает свет, что позволяет осуществлять длительную визуализацию глубоких структур головного мозга без необходимости лазерного возбуждения.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Кальциевый имиджинг
- Биолюминесцентный имиджинг
Теоретические сведения
- Кальциевые транзиенты служат индикаторами нейронной активности.
- Традиционные методы кальциевого имиджинга могут вызывать фотообесцвечивание и токсичность.
- Визуализация глубоких структур мозга затруднительна при использовании традиционных методов.
- Понимание базальной активности мозга имеет решающее значение для нейробиологических исследований.
Цель исследования
- Разработать метод длительной визуализации кальциевых транзиентов.
- Обеспечить возможность визуализации в глубоких областях мозга.
- Получить представление о базальной активности мозга мухи во время сна.
Используемые методы
- Использование слиткого конструкта GFP-aequorin.
- Подготовка линий Drosophila melanogaster для визуализации.
- Экспериментальные растворы согласно описанию в протоколе.
- Визуализация in vivo без лазерного возбуждения.
Основные результаты
- Успешная долгосрочная визуализация кальциевых транзиентов у Drosophila.
- Возможность доступа к глубоким структурам мозга без фотовыгорания.
- Представления о базальной активности мозга мухи.
- Потенциальная применимость к другим модельным организмам, таким как мыши.
Выводы
- Метод биолюминесцентной визуализации обладает значительными преимуществами по сравнению с классическими методами.
- Данный метод может углубить наше понимание нейробиологических процессов.
- В будущих исследованиях этот метод можно применять для различных модельных организмов.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Биолюминесцентная визуализация кальция с использованием GFP-эквиорина позволяет проводить долгосрочную функциональную визуализацию глубоких тканей in vivo без лазерного возбуждения, что решает основные проблемы фотовыгорания и токсичности, характерные для традиционных методов визуализации кальция. Данный подход обеспечивает непрерывный мониторинг нейронной активности в сложных нейронных цепях, служа индикатором базальных и стимулированных состояний мозга, что имеет важное значение для нейрофармакологии и валидации мишеней. Этот метод повышает прогностическую достоверность доклинических моделей, обеспечивая воспроизводимые количественные показатели динамики кальция в течение длительных периодов времени, что способствует снижению механистических рисков на ранних этапах разработки.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Раннее обнаружение и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем измерения транзиентов кальция как прямого индикатора активации нейронов в ответ на фармакологические стимулы.
- Практическая ценность: способствует функциональной валидации мишеней посредством продолжимой визуализации внутриклеточных потоков кальция с высоким временным разрешением в генетически определенных популяциях нейронов.
- Прогностическая ценность: повышает уверенность в связывании с мишенью и модуляции сигнального пути за счет регистрации как входящих транзиентов кальция, так и сигналов кальция, высвобождаемого из внутриклеточных депо, в динамике.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Позволяет создавать стабильные трансгенные биологические системы (например, Drosophila, мышь) с направленной экспрессией GFP-эквиорина для получения согласованных и воспроизводимых измерений потока ионов кальция.
- Количественные данные: Обеспечивает считывание данных на основе подсчета фотонов, что позволяет проводить кинетический анализ ответов, индуцированных агонистами (например, никотином или хлоридом калия), для определения зависимости «доза-эффект» и расчета EC50.
- Масштабируемость: Совместимость с перфузионными системами и автоматизированными платформами для фотонной визуализации позволяет проводить стандартизированный скрининг соединений на различных генотипах и в различных условиях.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для исследования заболеваний: облегчает изучение нейронных цепей обучения и памяти (например, грибовидных тел у Drosophila), где кальциевая сигнализация участвует в когнитивных функциях и нейропсихиатрических расстройствах.
- Трансляционная преемственность: позволяет проводить лонгитюдную визуализацию — от базовой активности через фармакологическое воздействие до восстановления, что поддерживает принятие решений о продвижении препаратов в доклинических исследованиях с учетом рисков.
- Снижение механистических рисков: уменьшает неопределенность в отношении механизма действия мишени, связывая воздействие соединения с количественными показателями динамики кальция в режиме реального времени в интактной нервной ткани.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в рабочие процессы раннего поиска препаратов в качестве функционального показателя после связывания с мишенью, связывая биохимические анализы и фенотипический скрининг путем обеспечения функциональной валидации модуляции нейронных мишеней в режиме реального времени.
- Поисковая биология: поддерживает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей посредством визуализации кальциевого отклика на нейромодуляторы (например, никотин) в определенных областях мозга, что позволяет снизить риски при выборе мишеней, участвующих в синаптической передаче.
- Скрининг: предоставляет воспроизводимые количественные данные о потоке ионов кальция с помощью подсчета фотонов, что позволяет сравнивать эффективность соединений и продолжительность их действия в разных экспериментальных группах.
- Аналитика: генерирует кривые скорости подсчета и показатели площади под кривой, что позволяет сравнивать величину отклика, кинетику и восстановление между различными условиями, поддерживая анализ зависимости «структура — активность» (SAR).
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность доклинических исследований, позволяя проводить визуализацию в консервативных цепях (например, в грибовидных телах), участвующих в формировании поведенческих реакций, с возможностью применения к моделям млекопитающих.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую платформу для визуализации в лонгитюдных исследованиях, снижая необходимость в повторной подготовке моделей и поддерживая стандартизацию между проектами.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: обеспечивает прогностическую уверенность в валидации мишени, позволяя напрямую наблюдать за кальций-опосредованной нейронной активностью без искажающих факторов фототоксичности или выгорания красителя.
- Операционная ценность: гарантирует воспроизводимость и стандартизацию за счет использования генетически кодируемых репортеров и контролируемых систем перфузии, что минимизирует вариативность между сериями экспериментов и лабораториями.
- Стратегическая ценность: оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), предоставляя устойчивые функциональные данные высокого разрешения, что снижает вероятность неудач на поздних стадиях из-за непредвиденных эффектов в нейронных сетях.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию соединений с учетом рисков на основе количественных профилей кальциевого отклика, поддерживая эффективность использования капитала при оптимизации ведущих соединений.
Особенности реализации
- Требуются навыки работы с генетическими модельными системами (например, GAL4/UAS у Drosophila) и методами молекулярной биологии для создания и валидации трансгенных линий.
- Метод зависит от инфраструктуры детектирования фотонов, включая камеры с охлаждением (-80°C), системы визуализации фотонов и системы перфузии для замены раствора.
- Необходима стандартизация загрузки целентеразина, времени инкубации и протоколов записи базового уровня для обеспечения сопоставимости образцов.
- При переносе данного подхода на другие виды (например, с мухи на мышь) требуются корректировки с учетом различий в проницаемости гематоэнцефалического барьера и доставке кофактора.
- Практические ограничения включают необходимость работы в темной комнате во время детектирования фотонов и осторожное обращение с целентеразином, который чувствителен к свету и требует свежего приготовления.
