Высокое разрешение Количественное кристаллической целлюлозы Накопление в Arabidopsis Корни для мониторинга Тканеспецифическая клеточной стенки Модификации

Общая цель этого анатомического сечения состоит в том, чтобы количественно оценить относительное накопление кристаллов и целлюлозы в клеточном разрешении, что позволяет проводить прямые сравнения между различными тканями в первичном корне арабидопсиса. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области физиологии и развития растений, например, как клеточный состав данного типа клеток влияет на рост целых органов. После стерилизации семян арабидопсиса в соответствии с текстовым протоколом разложите стерильные семена по пластинам, содержащим 0,8% растительного агара и 0,5ХМ среды.

Парапленкой оберните пластины и накройте алюминиевой фольгой. Храните пластины при температуре 4 градуса Цельсия от одного до четырех дней, чтобы обеспечить равномерное прорастание. Затем перенесите пластины в камеру роста, подходящую для выращивания рассады арабидопсиса, расположив пластины вертикально для поддержания роста корней поверх агаровой среды Приготовьте раствор Ричардсона в соответствии с текстовым протоколом Перед использованием профильтруйте через фильтрующий блок PVD 0,22 микрона с приводом от шприца.

Далее под химическим колпаком готовят 50 миллилитров фиксатора, соединив 38 мл 0,5М какодилата натрия с 2,5 мл глутарового альдегида. Затем добавьте 100 микролитров раствора Ричардсона в раствор для фиксации, чтобы получить окончательный раствор для фиксации. Используйте предварительно маркированную пластину, затем поместите в лунки от 2 до 3 мл раствора для окончательной фиксации так, чтобы раствор полностью покрыл рассаду.

С помощью пластиковых щипцов аккуратно переносят в каждую лунку до 10 саженцев. Используйте парапленку, чтобы запечатать пластины, прежде чем хранить в темноте при температуре 4 градуса Цельсия в течение как минимум одной ночи и до одной недели. Для обезвоживания неподвижных саженцев с помощью щипцов поднимают растения путем их переноса в лунки новых отмеченных шестилуночных пластин, содержащих возрастающие концентрации этанола в указанные здесь времена.

Приготовьте инфильтрационную среду в небольшом стеклянном флаконе, смешав содержимое одного пакетика активатора Historesin с 50 мл основной смоляной жидкости. Вставьте магнит и перемешивайте раствор на пластине для перемешивания в течение 20 минут. Заполните промаркированные лунки шестилуночной пластины 2-3 мл инфильтрационной среды.

Затем, когда рассада полностью обезвожена, с помощью щипцов перенесите ее из раствора 95% этанола в инфильтрационную среду, убедившись, что она полностью покрыта средой. Храните образцы при температуре 4 градуса Цельсия не менее четырех дней, чтобы обеспечить максимальное проникновение в ткани растения. Для приготовления блоков поместите небольшие этикетки карандашом, помеченные с названием образца, внутрь каждой лунки заложите формочки.

Приготовьте загрузочную среду, добавив 1 мл отвердителя к 15 мл инфильтрационной среды. Примерно 200 микролитрами закладочной среды заполните по половине каждого лунки в форму. И используйте верхний кусок пленки, чтобы накрыть форму дополнительным 1 мл с каждой стороны.

Инкубируйте формы при комнатной температуре не менее двух часов, чтобы обеспечить частичную полимеризацию. Затем приготовьте дополнительную порцию закладочной среды и держите ее на месте, чтобы избежать полимеризации, пока кончики корней располагаются в форме. Добавьте закладную среду в небольшую тарелку и поместите в среду по одному саженцу.

С помощью рассекающего прицела разрежьте кончик каждого корня скальпелем, затем очень осторожно расположите его в форме на расстоянии от 2 до 3 мм от периферии формы либо вертикально для передаточных сечений, либо горизонтально для продольных срезов. После расстановки ткани с помощью закладочной среды заполните форму полностью, и накройте накладной пленкой. Затем инкубируйте при комнатной температуре не менее двух часов. Чтобы высушить блоки, поместите их в эксикатор с сухим силикагелем и оставьте при комнатной температуре на ночь.

С помощью ножевого аппарата, оснащенного алмазным подрезным инструментом, подготовьте стеклянные ножи из стеклянных стержней, разрезав стеклянную дорожку на квадрат, а затем разрезав квадрат по диагонали, изготовьте два ножа. Убедитесь, что оба ножа имеют острые края. Установите блок в держатель.

Затем с помощью промышленного лезвия с одной кромкой удалите излишки материала блока на расстоянии до одного мм от кончика корня, чтобы получить форму пирамиды. Разделите формованный блок на ломтики шириной от 2 до 3 микрон и перенесите срезы на отмеченное стеклянное стекло. Затем добавьте капли воды на ломтики.

Важно подготовить равномерные по ширине разделы, чтобы свести к минимуму вариативность анализируемых данных. Поместите стеклянные предметные стекла на нагревательные блоки, установленные на слабый огонь, пока вода не испарится. Для подготовки предметных стекол для просмотра под поляризационным микроскопом разбавьте раствор Ричардсона до 2% от исходного раствора и используйте около 1мл для покрытия срезов.

Затем поместите образцы на термоблок на 5 секунд и промойте их дистиллированной водой. После высыхания предметных стекол на горячей плите осмотрите срезы под микроскопом и с помощью маркера отметьте обратную сторону предметного стекла, чтобы указать положение интересующих их срезов. Добавьте 100 микролитров монтажного материала перед тем, как накрыть крышкой.

Изображение и анализ в соответствии с текстовым протоколом. Здесь показан поперечный разрез первичного корня Arabidopsis с радиальной организацией составляющих его клеток и тканей, включая неволосковые клетки, волосковые клетки и кору головного мозга. На этом конфокальном изображении показана экспрессия BRI1-GFP в неволосковых клетках на мутантном фоне BRI1, который ингибирует однонаправленное расширение соседних клеток и рост всего корня.

Как видно на рисунке, продольные срезы корней, полученные по дикому типу и по линиям, экспрессирующим BRI1 в неволосковых клетках, показали сходную ориентацию целлюлозных микрофибрилл с высокой вариабельностью углов, присутствующих в меристемных клетках, по сравнению с клетками в переходной зоне. Это позволяет сравнить относительное накопление кристаллов в целлюлозе в соответствующих меристемных и удлиненных клетках двух генетических фонов, как показано здесь в поперечных срезах, и выявить корреляцию между экспрессией BRI1 в клетках, не относящихся к волоску, и высоким локальным накоплением кристаллов в целлюлозе. Как правило, в видеороликах новички в этом методе будут испытывать трудности, потому что во время процедуры заделки сложно получить хорошо ориентированные корни.

Поэтому следует подготовить несколько блоков для секционирования. После освоения секция одного блока может быть выполнена за 2-3 часа. При проведении этой процедуры важно помнить, что накопление кристаллов в целлюлозе сопоставимо между клетками, если они имеют схожую ориентацию ее целлюлозных микрофибрилл, определяемую продольными срезами.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как закрепить рассаду арабидопсиса и как заделывать ее в блоки, а также как затем подготовить продольные и поперечные сечения корней. Вы также должны иметь хорошее представление о данных, которые можно получить с помощью поляризационной световой микроскопии.