Непосредственное определение характеристик гидратированных белков в воде SALVI и TOF-SIMS

Общая цель этой процедуры заключается в определении характеристик адсорбированных белковых пленок в водных растворах с использованием системы анализа на границе раздела Liquid Vacuum и времяпролетной масс-спектрометрии вторичных ионов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о биомолекулах и биоинтерфейсе. Например, характеристика адсорбированных белков на твердой поверхности.

Основные преимущества этого метода заключаются в том, что биомолекулы могут быть запущены in situ в жидкой среде и в сочетании с молекулярным картированием. Хотя этот метод может дать представление о биомолекулах на границе твердого и жидкого тела, он также может быть применен к другим системам, включая исследование отдельных раковых клеток, взаимодействие лекарственных препаратов и прикрепление биопленок. В пятимиллилитровый шприц наберите два миллилитра 70%-ного раствора этанола.

Подсоедините шприц к входному концу устройства SALVI и медленно вводите один миллилитр жидкости в течение 10 минут. В конце инъекции извлеките шприц и соедините входное и выходное отверстия SALVI с помощью соединения полиэфир-эфир-кетон. Держите микроканал SALVI заполненным 70%-ным раствором этанола при комнатной температуре в течение четырех часов.

Затем наполните второй шприц стерильной деионизированной водой. Подключите его к входному отверстию SALVI и медленно впрыскивайте деионизированную воду в устройство в течение 10 минут. Извлеките шприц и снова соедините входное и выходное отверстия устройства вместе.

Для того чтобы обездвижить белковую пленку, начните с набора в шприц двух миллилитров раствора фибронектина. Подсоедините шприц к входному отверстию устройства SALVI и медленно вводите один миллилитр жидкости в течение 10 минут. Затем извлеките шприц и снова подсоедините входное и выходное отверстия.

Инкубируйте установку в чистой питательной посуде при комнатной температуре в течение 12 часов. После инкубации медленно вводите один миллилитр стерильной деионизированной воды в течение 10 минут, а затем снова подключите входное отверстие к выпускному. Для начала положите столик ToF-SIMS на ровную чистую поверхность.

Поместите устройство SALVI на сцену так, чтобы мембрана из кремниевой пластины и нитрида кремния была обращена вверх. Закрепите устройство SALVI на сцене с помощью четырех металлических зажимных частей, а металлические детали, удерживающие угол устройства, вкрутите в металлическую пластину четырьмя винтами. Затем аккуратно сверните трубку PFTE, подключенную к микрофлюидному каналу.

Используйте четыре металлические детали и четыре винта, чтобы удерживать жесткую часть внизу. Убедитесь, что устройство расположено на открытом пространстве на сцене, чтобы оно не мешало основному ионному пучку во время анализа. Далее установите чашку Фарадея на сцену с помощью винта.

Затем откройте дверцу загрузочного замка ToF-SIMS и установите сцену горизонтально на грузовую платформу, прежде чем закрыть дверь. Включите вакуумный насос и дайте камере загрузочного замка откачаться примерно до 10 до минус шестого миллибар. Затем переместите устройство SALVI в основную камеру примерно через 30 минут, как только вакуум стабилизируется.

Настройте первичный ионный пучок и анализатор ToF-SIMS для получения пространственного разрешения примерно 400 нанометров, следуя протоколу, рекомендованному производителем. Далее найдите микрофлюидный канал с помощью оптического микроскопа. Используйте центр оптического изображения в качестве образца и выровняйте его так, чтобы он соответствовал центру изображения вторичных ионов.

Визуальная демонстрация этого шага имеет решающее значение, так как его сложно освоить, потому что образец толще, чем обычные твердые сэмплы, и сложно отрегулировать настройки, чтобы найти лучший фокус канала. Перед каждым измерением используйте кислородный пучок в один килоэлектронвольт для сканирования окна из нитрида кремния в течение примерно 15 секунд, чтобы удалить поверхностное загрязнение. Кроме того, используйте электронный пистолет для компенсации поверхностного заряда во время всех измерений.

Далее выберите положительный или отрицательный режим перед началом сбора данных. Используйте висмут 25 килоэлектронвольт три плюс в качестве первичного ионного пучка во всех измерениях. Для профилирования глубины сканируйте первичный ионный пучок на круглой области диаметром около двух микрометров с разрешением 32 на 32 пикселя.

Чтобы свести к минимуму время, необходимое для пробивки мембраны из нитрида кремния, используйте пучок первичных ионов с длительной шириной импульса. После пробития мембраны из нитрида кремния удерживайте тот же ток в течение примерно 200 секунд, чтобы получить достаточные данные для реконструкции двумерного изображения. Для сбора данных уменьшите длительность импульса до 80 наносекунд, чтобы получить спектры с лучшим массовым разрешением.

Продолжайте сбор данных еще около 200 секунд. Используя микрофлюидный интерфейс Salvi, первичный ионный пучок может непосредственно бомбардировать гидратированную пленку фибронектина. Ряд водных кластеров и фрагментов аминокислот обозначен масс-спектрометрическими данными ToF-SIMS.

Это дает прямое доказательство свойств молекул воды вокруг и внутри гидратированных белковых молекул. Здесь можно увидеть временные ряды профиля глубины пленки гидратированного фибронектина и деионизированной воды. Интенсивность выбранных вторых ионов пренебрежимо мала до тех пор, пока мембрана из нитрида кремния не будет пробита.

Как только мембрана из нитрида кремния пробивается, интенсивность вторичных ионов значительно возрастает. Процесс короткой длительности импульса используется для получения данных с лучшим массовым разрешением для реконструкции изображений и спектра. Двумерные изображения из гидратированной пленки фибронектина и деионизированной воды представляют собой количество выбранных вторичных ионов из образца.

Чем ярче изображение, тем выше количество вторичных ионов. Эти интуитивно понятные изображения позволяют четко сравнивать выбранные вторичные ионы между различными образцами, что полезно при анализе данных. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что микрореактор должен быть герметичным перед установкой в вакуумную камеру.

Этот метод проложил путь исследователям в области биологии и биоинтерфейсов к изучению адсорбции белков, прикрепления биопленки, поверхностно собранных монослоев и многих других явлений. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как изучать различные образцы жидкости с помощью SALVI и жидкого ToF-SIMS.