Новые Метрики к характеризации эмбриональных Удлинение нематоды Caenorhabditis Элеганс

Общая цель этой группы экспериментов заключается в выявлении дефектов развития у нематоды Caenorhabditis elegans на ранних и поздних стадиях элонгации эмбриона. Этот метод может ответить на ключевой вопрос в области генетики развития. Это позволяет охарактеризовать гены, контролирующие позднюю стадию эмбрионального развития Caenorhabditis elegans, называемую эмбриональной элонгацией.

Основное преимущество этой группы методик заключается в том, что они идентифицируют гены, контролирующие либо раннюю, либо позднюю стадию удлинения, а также те, которые контролируют морфогенные процессы в передней или задней части эмбриона. Я продемонстрирую эту процедуру вместе с Оливье Рошело-Леклером, бывшим студентом лаборатории. Для этой процедуры требуются объективы DIC, призма и система видеозахвата для покадровой микроскопии стеков Z.

Во-первых, расположите образец на слайде для просмотра. Детали подготовки есть в текстовом протоколе. Начиная с малого увеличения, идентифицируйте эмбрионы на стадиях их преморфогенеза.

Затем добавьте каплю масла и используйте более мощный объектив. Теперь определите верхнюю и нижнюю точки эмбрионов для записи и установите параметры стека Z. Установите интервальную съемку так, чтобы делать снимки каждые две минуты.

Убедитесь, что световой затвор закрыт между получением изображения. Время, необходимое для фиксации события ранней элонгации, может варьироваться от одного до восьми часов, в зависимости от стадии эмбриона. Теперь запустите программу получения изображений и сохраните результаты.

Далее приступаем к их анализу с помощью программного обеспечения Fiji ImageJ. После загрузки изображений выберите режим просмотра Hyperstick. В нем отрегулируйте яркость и контрастность, применив автоматический режим из таблиц поиска.

Затем перейдите в раздел «Анализ измерений набора» и установите параметры. Для каждого эмбриона установите шкалу Z так, чтобы она фокусировалась на глотке, которая является хорошим ориентиром для центральной точки эмбриона. Теперь настройте шкалу времени на начало ранней элонгации для конкретного эмбриона.

Обратите внимание на это время. Затем рассчитайте длину эмбро с помощью инструмента «Анализ измерения», чтобы провести линию от кончика хвоста до рта вдоль средней линии. Обратите внимание на эту длину.

Затем отрегулируйте временную точку до конца события раннего удлинения и повторите измерение длины. Используйте эти значения для вычисления продолжительности раннего удлинения и увеличения длины при раннем удлинении. Изменение ширины также можно измерить с помощью инструмента «Прямая линия», чтобы провести линию через среднюю линию головы.

Это хорошее место для последовательных измерений. Проделайте то же самое на средней линии хвоста, затем рассчитайте соотношение головы и хвоста для любой временной точки и используйте это для оценки изменений в ширине. Для этого протокола проточный цитометр должен быть подготовлен к потоку крупных частиц.

Такая машина по сути становится сортировщиком червей. Перед началом пуска лазерного блока, компрессора, сортировщика червяков и программного обеспечения. В программном обеспечении нажмите «Пуск» и проверьте управление аргоновым лазером.

Выберите режим «Работа» и дайте лазеру нагреться почти до 10 милливатт, затем нажмите «Готово». Дайте давлению уравновеситься не менее 15 минут. Теперь подготовьте образец.

Для начала загрузите 10 микролитров синхронизированного дикого типа L1 в стекло часов и оцените долю мертвых яиц под микроскопом. Если оценка превышает 20%, не используйте выборку. Перелейте около 700 микролитров синхронизированного L1 в растворе М9 в 15-миллилитровую пробирку и добавьте йодид пропидиума до 10 микрограммов на миллилитр.

Дайте пятну подействовать в течение 30 минут при комнатной температуре. Теперь подготовьте систему. Крайне важно отрегулировать расход с помощью контроллеров тубуса и потока проб на 5,1 и 5,51 соответственно.

Когда давление стабилизируется, нажмите на поле Pressure Okay. Затем используйте команду «Получить» и вручную прокрутите трубочку, чтобы удалить все пузырьки из канала между чашкой для образца и камерой для анализа. В конечном итоге в окне сбора данных будет показано, что пузырьков нет.

Это также жизненно важно для эксперимента. Теперь установите параметры для измерений флуоресцентных ламп и TOF. Установите шкалы для TOF, EXT, Зеленого, Желтого и Красного на 256.

Затем установите Gain (Усиление), как указано на заметке. Затем установите регулятор PMT на 700 для зеленого и желтого цветов и на 900 для красного. Теперь откалибруйте сортировщик червей.

Загрузите 20 миллилитров высокофлуоресцентных контрольных частиц общего назначения в чашку для образцов и загрузите ее в сортировщик. В программном обеспечении выберите «Запустить контрольные частицы» в разделе «Инструменты» и нажмите «Получить». Убедитесь, что результирующий коэффициент вариации больше или равен 11, а среднее равно 21 плюс-минус шесть.

Если это не так, попробуйте очистить канальцы, нажав на кнопку «Очистить» или щелкнув по каналу потока. Теперь выйдите из режима Control Articles, сняв галочку с команды в Tools. Как только 30-минутное окрашивание червей йодидом пропидиума будет закончено, добавьте 10 миллилитров М9 к окрашенным червям и перемешайте.

Выдерживать не менее 15 минут при комнатной температуре. Теперь возьмите пять миллилитров разбавления и добавьте его в чашку для образца с 15 миллилитрами M9. Пропустите это разведение через сортировщик червей. Нажмите кнопку «Захватить» и наблюдайте за расходом.

Возможно, потребуется отрегулировать концентрацию червей, чтобы получить хороший поток, где-то между 15 и 25 объектами в секунду. Как только будет достигнута соответствующая концентрация объектов, добавьте в тест контрольные частицы, чтобы получить концентрацию контрольных частиц в растворе примерно от 0,5 до 1x. Теперь настройте параметр стробирования в меню Стробирование на TOF против Зеленого.

Затем настройте параметры сортировки на TOF против Красного. Это позволит отсортировать контрольные частицы от мертвых и живых животных. Теперь запустите эксперимент, нажав кнопку Получить.

Проанализируйте около 10 000 объектов, которые соотносятся примерно с 8 000 животных. Затем остановите эксперимент и нажмите кнопку Сохранить, чтобы сохранить данные в виде текстового файла для анализа. Чтобы установить надежность измерения ширины головы, измерение проводили независимо пять раз на 12 эмбрионах дикого типа на стадии 1,2 раза.

Расхождения между данными при применении теста Брауна-Форсайта отсутствовали. Воспроизводимость и пакетные эффекты, связанные с измерением ширины головы, были протестированы с помощью 4D DIC визуализации в течение трех разных дней. В этих трех группах измерений не было обнаружено дисперсии или пакетных эффектов.

Оба описанных протокола были использованы для оценки длины задержанных личинок в диком типе и на фоне мутантов. Анализ изображений позволил измерить абсолютные размеры длины в микрометрах. В этом эксперименте мутанты были меньше, чем дикие виды.

Измерение длины методом проточной цитометрии дало сопоставимые результаты. Тем не менее, эти измерения были гораздо более надежными. Таким образом, этот метод должен пролить свет на более тонкие эффекты в мутантных популяциях.

При попытке выполнить эту процедуру важно поддерживать постоянную скорость потока на протяжении всего эксперимента, чтобы обеспечить справедливое сравнение между анализируемым штаммом. После освоения измерение длины личинки с помощью проточной цитометрии позволяет характеризировать от 18 до 24 состояний или мутантных штаммов в день, даже с учетом первоначальной калибровки оборудования. После этой процедуры мы можем изучить морфологию гиподермальных клеток.

Для этого мы можем использовать флуоресцентный маркер и конфокальную микроскопию для характеристики молекулярной функции идентифицированных генов. Не забывайте, что йодид пропидиума может быть чрезвычайно опасным, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток и защитных очков.