Градиент штамм чип для стимулирования клеточных поведения в ячейке Ладена Гидрогель
8 августа 2017 г.
Эта статья знакомит простой подход к обеспечению непостоянного градиента статические штаммов на концентрические клеток Ладена гидрогеля регулировать выравнивание ячеек для тканевой инженерии.
Общая цель этого чипа с градиентной деформацией заключается в том, чтобы обеспечить простой подход к генерации ненепрерывных градиентных статических деформаций на 3D-гидрогеле для исследования поведения клеток в ряде напряженных условий. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биоинженерии, такие как стимуляция дифференцировки стволовых клеток и регулирование клеточного выравнивания для развития искусственных тканевых органов. Основное преимущество данной методики заключается в том, что на клеточный слой и гидрогели можно наносить различные штаммы в одной и той же микросреде для сравнения поведения клеток.
Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы подготовки чипа сложны для изучения, так как освещение должно быть завершено за три-четыре часа, чтобы основа эксперимента могла обеспечить высокую вариабельность клеток. Взвесьте 10 граммов желатинового порошка и добавьте его в стеклянную колбу со 100 миллилитрами фосфатно-солевого буфера Дульбекко, или DPBS. Вставьте в колбу магнитную мешалку и поставьте колбу на горячую плиту для перемешивания.
Накройте колбу алюминиевой фольгой, чтобы избежать испарения воды. Установите температуру горячей плиты на 50-60 градусов, а мешалку на 100 об/мин на один час, чтобы растворить желатиновый порошок. После того как желатин растворится, очень медленно добавляйте восемь миллилитров метакрилового ангидрида с помощью пипетки.
Дайте ему вступить в реакцию при температуре 60 градусов Цельсия в течение трех часов. Затем добавьте в колбу предварительно подогретый DPBS до конечного объема 500 миллилитров. Дайте раствору хорошо перемешаться в течение 15 минут, чтобы остановить реакцию.
Тем временем разрезаем диализную мембрану на несколько трубок длиной 25 миллиметров. Погрузите их в деионизированную воду на 15 минут. И завяжите узел, чтобы закрыть один конец диализных трубок.
Загрузите соответствующее количество полимерного раствора в диализные трубки и закройте другой конец. Затем поместите заполненные трубки в пятилитровый пластиковый стакан с деионизированной водой на неделю. Обновляйте деионизированную воду два раза в день и поддерживайте температуру раствора на уровне от 40 до 50 градусов Цельсия во время процесса диализа.
После диализа соберите раствор из пробирок в стеклянную бутылку объемом 500 миллилитров. Налейте примерно от 450 до 500 миллилитров раствора в 500-миллилитровый фильтрующий стаканчик. И примените вакуум, чтобы заставить раствор пройти через фильтрующую мембрану для стерилизации.
Затем переложите стерилизованный полимер в несколько стерилизованных пробирок объемом 50 миллилитров. Переложите стерилизованный полимер в несколько стерилизованных пробирок объемом 50 миллилитров и храните их в морозильной камере при температуре минус 80 градусов Цельсия в течение трех-пяти дней. Сублимационную сушку полимера при температуре минус 80 градусов Цельсия в течение одной недели с помощью сублимационной сушилки для образования GelMA, который затем можно хранить в морозильной камере при температуре минус 80 градусов Цельсия.
Для изготовления чипа сначала подготавливают полиметакрилат или ПММА, играют и формуют, как описано в текстовом протоколе. Затем приготовьте крышку PTMS и пробку PTMS, тщательно смешав 30 граммов эластомера PTMS и три грамма отвердителя PTMS. Дегазируйте смесь под вакуумной камерой в течение одного часа.
Отлите от 1,8 до двух граммов смеси в форму из ПММА для крышки PTMS. Также используйте соответствующее количество для заполнения каждой полости для формы из ПММА для пробки PTMS. Кроме того, отлить 10 грамм неотвержденной смеси ПТМС в пустую 10-сантиметровую пластиковую пластину.
Поместите эти формы в вакуумную камеру для дегазации на 30 минут. Отверждайте ПТМС в течение двух часов при температуре 80 градусов Цельсия. После охлаждения отвержденной PTMS на пресс-форме отсоедините крышки PTMS и заглушки PTMS от форм из ПММА.
Далее пробиваем два отверстия диаметром около трех миллиметров на концах проточных каналов крышек ПТМС. Разрежьте лист ПТМС, отлитый из 10-сантиметровой пластиковой пластины, на множество кубиков размером один сантиметр на один сантиметр. И проделайте трехмиллиметровое отверстие в каждом кубике PTMS.
Приклейте два неотвержденных куба PTMS размером один на один сантиметр к отверстиям крышки PTMS, чтобы они служили средними резервуарами и помогали в процессе отверждения градиентных круговых гидрогелевых узоров. Затем выдерживают в течение часа при температуре 80 градусов по Цельсию. Затем приклейте крышки PTMS с двумя резервуарами PTMS к предметному стеклу с покрытием TMSPMA.
Для этого предварительно обработайте склеивающую сторону крышки PTMS и предметное стекло с покрытием TMSPMA под кислородно-плазменным аппаратом в течение 90 секунд кислородной плазменной обработки. Соприкоснитесь с обработанной плазмой поверхностью крышек PTMS и слайдом TMSPMA и плотно прижмите их для прочного соединения за счет образования кремниево-кислородно-кремниевой связи. Распечатайте фотошаблон, распечатав установленный макет на прозрачной пленке.
Затем разрежьте напечатанный фотошаблон до размеров 25 миллиметров на 37,5 миллиметров. Взвесьте 25 мг лиофилизированного GelMA в 0,3 мл предварительно подогретой среды для клеточных культур в черной микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл. Поместите микроцентрифужную пробирку на горячую пластину лабораторной мешалки до тех пор, пока GelMA не растворится в среде.
Добавьте 50 миллиграммов фотоинициатора к одному миллилитру DPBS в микроцентрифужной пробирке. И поместите его в духовку при температуре 80 градусов Цельсия на 15 минут или пока фотоинициатор не растворится. Добавьте 25 микролитров 10%-ного фотоинициатора в микроцентрифужную пробирку.
Пипеткой несколько раз хорошо перемешать. Затем подсчитайте три миллиона клеток NIH3T3 с помощью автоматического счетчика клеток. После центрифугирования суспензии при 200 G в течение пяти минут отбросить надосадочную жидкость и повторно суспендировать клетки в 175 микролитрах среды для культивирования клеток.
Добавьте раствор ячейки в микроцентрифужную пробирку, чтобы получить раствор предварительной полимерной ячейки из 5% GelMA, 0,5% фотоинициатора и около шести миллионов 3T3 клеток на миллилитр. После смешивания загрузите 100 микролитров клеточного преполимера в микрошприц объемом 100 микролитров. Вручную совместите часть фотошаблона с нижнего предметного стекла стерилизованной градиентной деформационной микросхемы.
И просто зафиксируйте положение, используя небольшую каплю деионизированной воды между ними. Подсоедините микрошприц объемом 100 микролитров, загруженный раствором преполимерной ячейки, к входному отверстию чипа. Затем поместите 50 микролитров раствора преполимерной ячейки в проточный канал с помощью микрошприца и закупорьте выходное отверстие с помощью пробки PTMS.
Введите дополнительные 40 микролитров раствора, чтобы создать выпуклую выпуклость в круглой мембране PTMS. Переместите чип с фотомаской, микрошприцем и заглушкой PTMS под УФ-лампу. И выдержите его на 30-45 секунд, чтобы сшить концентрический круговой гидрогель в жидкостной камере.
После сшивания снимите пробку PTMS и микрошприц, чтобы сбросить давление жидкости. С помощью одномиллилитрового шприца, загруженного предварительно подогретым DPBS, трижды смойте несшитые смолы путем промывки от входа к выходу. Далее заполните проточный канал примерно 100 микролитрами среды для культивирования клеток.
Поместите чипсы в стерилизованную чашку для культивирования и закваливайте в атмосфере с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия в течение недели. Обновляйте средство каждый день. Сделайте снимки трех чипов в нулевой день после четырех часов инкубации в качестве контрольной группы.
И три чипа на третий день в качестве экспериментальной установки с использованием микроскопа с 20-кратным объективом. Измерьте ширину линии каждого гидрогеля от первой до 12-й линии с помощью программного обеспечения для расчета пятен от компресса. Здесь представлены репрезентативные результаты гидрогелевых структур с нулевым содержанием микролитра и 40 микролитров при инъекции, после УФ-сшивки и четырехчасовой инкубации.
Ширина линии 3D-гидрогеля в регуляторе без избыточного впрыска выглядит равномерной, как и ожидалось. Тем не менее, шаблоны гидрогеля с 40 микролитрами над инъекцией дают градиентную ширину линии гидрогелей, уменьшающуюся от первой линии до 12-й. После трех дней инкубации клетки в гидрогеле распространяются в разные стороны.
Ячейки в первой линии выравниваются в радиальном направлении за счет стимуляции удлинения гидрогеля. Напротив, клетки на линии 12 выравниваются по форме гидрогеля, где геометрия доминирует над клеточным выравниванием. В строке 7 нет специфического выравнивания ячеек, в котором два сигнала выравнивания клеток первой и 12 уравновешивают друг друга.
Единожды измерение микроокружения градиентных деформаций на 3D гидрогеле можно сделать с помощью чипа градиентной деформации за два часа, если оно выполнено правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о необходимости стерилизации чипа градиентного штамма перед загрузкой раствора преполимера ячейки. Также тщательно протрите поверхность чипа 75% этанолом перед помещением чипсов в инкубатор для клеточных культур.
После просмотра этого видео у вас должно быть очень хорошее понимание того, как создать чип градиентного штамма для исследования поведения клеток под различными британскими штаммами.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен простой подход к созданию неоднородных градиентных статических деформаций в концентрическом гидрогеле с включенными клетками для регулирования их ориентации в задачах тканевой инженерии. Чип для создания градиентной деформации предназначен для изучения поведения клеток в различных условиях механического напряжения.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Тканевая инженерия
- Поведение клеток
- Биоинженерия
Теоретические основы
- Понимание ориентации клеток имеет решающее значение для разработки искусственных тканей.
- На дифференцировку стволовых клеток могут влиять механические стимулы.
- Существующим методам может не хватать возможности прикладывать различные деформации в контролируемой среде.
- Визуальная демонстрация подготовки чипа необходима для обеспечения воспроизводимости.
Цель исследования
- Разработать метод создания статических деформаций с прерывистым градиентом.
- Исследовать влияние этих деформаций на ориентацию и поведение клеток.
- Обеспечить возможность сравнения клеточных ответов в единообразном микроокружении.
Используемые методы
- Приготовление 3D-гидрогеля с использованием желатина и DPBS.
- Приложение градиентных статических деформаций к гидрогелю с клетками.
- Наблюдение за поведением клеток при различных условиях деформации.
- Визуальная документация процесса подготовки чипа.
Основные результаты
- Продемонстрирована возможность применения различных деформаций на гидрогеле.
- Показано, как условия деформации влияют на выравнивание клеток.
- Получены новые данные о механизмах дифференцировки стволовых клеток.
- Подчеркнута важность единообразия микроокружения в экспериментах.
Выводы
- Чип с градиентной деформацией является ценным инструментом для исследований в области тканевой инженерии.
- Он позволяет изучить влияние механических факторов на поведение клеток.
- Будущие исследования могут опираться на данный метод для совершенствования процессов развития тканей.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный чип с градиентом деформации позволяет контролируемо исследовать клеточные ответы на механические стимулы в 3D-гидрогелях, решая ключевую проблему тканевой инженерии и регенеративной медицины. Создавая в единой микрофлюидной среде непостоянные статические градиенты деформации, данный метод способствует механистическому снижению рисков при разработке биоматериалов и прогностическому моделированию поведения клеток под воздействием физиологически релевантных механических сигналов. Эта возможность оптимизирует рабочие процессы валидации мишеней и разработки анализов, предоставляя воспроизводимую платформу для скрининга влияния механических градиентов на ориентацию, дифференцировку и формирование тканей, что является критически важным для релевантности доклинических моделей и поиска трансляционных биомаркеров.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать, как градиентные механические деформации модулируют выравнивание и фенотип клеток, что способствует валидации мишеней в путях механотрансдукции.
- Практическая ценность: обеспечивает возможность параллельного сравнения поведения клеток в спектре деформаций (15–65%) на одном чипе, что снижает экспериментальную вариабельность и повышает производительность при проверке гипотез.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет создавать количественно определяемые изменения геометрии гидрогеля (градиенты ширины линий), которые коррелируют с приложенной деформацией, что обеспечивает стандартизированные показатели для анализов клеточного ответа.
- Практическая ценность: устраняет необходимость в использовании внешних приборов для создания деформации за счет самопроизвольного формирования градиентных микроокружений после УФ-сшивания, что повышает воспроизводимость анализа и снижает риск контаминации в стерильных рабочих процессах.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: имитирует механическую неоднородность нативной ткани, что повышает релевантность моделей in vitro для изучения фиброза, заживления ран и биоинженерии опорно-двигательного аппарата.
- Практическая ценность: обеспечивает возможность длительного культивирования (до 7 дней) с обновлением среды, позволяя оценивать временную адаптацию клеток к механическим градиентам в рамках доклинических исследований непрерывности.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум от открытия до доклинических исследований, обеспечивая механистический скрининг биоматериалов на ранних этапах в настраиваемых механических условиях, что способствует идентификации перспективных кандидатов и снижению рисков перед валидацией in vivo.
- Биологические исследования: облегчает проверку гипотез о том, как механические градиенты влияют на организацию цитоскелета и ядерную сигнализацию в гидрогелях, содержащих клетки.
- Скрининг: позволяет получать количественные, пространственно-разрешенные профили деформации путем измерения ширины линий гидрогеля, обеспечивая стандартизированные и сопоставимые результаты для различных экспериментальных условий.
- Аналитика: предоставляет морфометрические данные на основе визуализации (углы выравнивания клеток, параметры порядка ориентации), что позволяет проводить статистическое сравнение ответов на воздействие деформации.
- Трансляционные исследования: связывает биологию развития и доклиническое моделирование путем воспроизведения градиентов деформации, наблюдаемых в развивающихся или заживающих тканях.
- Корпоративное использование: конструкция флюидного чипа позволяет проводить несколько повторов и использовать различные условия за один запуск, что способствует стандартизации платформы между группами и проектами в рамках программ скрининга в области механобиологии.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность в исследованиях взаимодействия клеток с материалами за счет разделения топографических и основанных на деформации сигналов управления, что повышает уверенность в точности воздействия на целевые объекты.
- Операционная ценность: Стандартизирует подготовку гидрогеля и приложение деформации посредством изготовления GelMA методом диализа и сшивания под действием УФ-излучения, что повышает воспроизводимость результатов в различных центрах.
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки биоматериалов путем определения порогов деформации, вызывающих нежелательные фенотипические сдвиги (например, потерю выравнивания, хаотическую организацию).
- Влияние на портфель проектов: Позволяет осуществлять приоритизацию составов гидрогелей с учетом рисков, основываясь на их способности поддерживать направленное выравнивание клеток в физиологических диапазонах деформации.
Особенности реализации
- Требуется опыт в сборке микрофлюидных устройств, УФ-фотолитографии и синтезе гидрогелей (приготовление GelMA путем диализа и стерилизации).
- Необходимо наличие вакуумных камер, нагревательных плит, установок для обработки кислородной плазмой, УФ-ламп и стерильных инкубаторов для культивирования клеток.
- Требуются стандартизированные протоколы склеивания чипов, выравнивания фотошаблона и заполнения флюидами для обеспечения стабильного формирования градиента.
- Адаптация для других типов клеток (помимо NIH3T3) может потребовать оптимизации плотности клеток, концентрации GelMA и уровня фотоинициатора для сохранения жизнеспособности и функциональности.
- Практические ограничения включают временное окно УФ-экспозиции в 3–4 часа для стабильности преполимера, а также необходимость тщательной очистки для предотвращения образования пузырьков при склеивании.
