En Face Detection оксида азота и супероксид в эндотелиальный слой малонарушенных артериях

Общая цель этой процедуры заключается в одновременном обнаружении внутриклеточных анионов оксида азота и супероксида азота с помощью флуоресцентного красителя DAF-2DA и DHE в свежевыделенных интактных аортах мышей. Этот метод может помочь в лабораторном восстановлении случая исследователя в области сердечно-сосудистой физиологии, такой как эндотелиальная дисфункция и разъединение eNOS. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он обеспечивает простой и точный метод прямого обнаружения ex vivo и визуализации оксида азота и супероксид-аниона одновременно в неповрежденных кровеносных сосудах.

Для этого протокола постройте систему органных ванн, которая может нагреваться до 37 градусов Цельсия и аэрироваться 95% кислорода и 5% углекислого газа из баллона с углекислым газом. Для начала приготовьте достаточное количество свежего буфера для бикарбоната Krebs-Ringer по мере необходимости, чтобы искупать интересующие ткани. Например, для аорты в одном эксперименте нужно 200 миллилитров.

Включите систему органной ванны и отрегулируйте контроль нагрева на 37 градусов Цельсия. После промывки камер бикарбонатным буфером Krebs-Ringer добавьте по пять миллилитров бикарбонатного буфера Krebs-Ringer в каждую камеру и включите газ, чтобы аэрировать его 95% кислорода и 5% углекислого газа на 30 минут. Держите камеры закрытыми.

Также приготовьте бутылку ледяного бикарбонатного буфера Krebs-Ringer с аэрацией. После иссечения грудной аорты немедленно погрузите всю ткань в чашку с ледяным буфером Кребса-Рингера. Под микроскопом вскрытия удалите сердце и дугу аорты, сохранив при этом грудной сегмент аорты в буфере.

Затем рассеките аорту, свободную от прилипшей периваскулярной ткани, с помощью хирургических ножниц и щипцов. Затем с помощью щипцов захватите край ткани и аккуратно промойте кровь из просвета сосудов с помощью ледяного буфера Кребса-Рингера, подаваемого из шприца. Сгустки крови в просвете сосудов должны быть удалены, потому что они могут вызывать искусственные сигналы и мешать флуоресцентным сигналам, в то же время следует контролировать силу прилива, чтобы не повредить эндотелиальный слой.

Теперь разрежьте очищенные кольца аорты на отрезки длиной три миллиметра. После подготовки очищенных колец аорты, окрасьте их. Прикасаясь щипцами только к придаточной стороне аортальных колец, не пережимая кровеносные сосуды, перенесите очищенные сегменты аорты в подготовленные камеры органной ванны.

Дайте артериям уравновеситься в буфере в течение 30 минут. Через полчаса добавьте ацетилхолин в органную ванну, чтобы получить окончательную концентрацию в один микромоляр, и инкубируйте артерии в течение 10 минут с ацетилхолином. Тем временем в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитра приготовьте миллилитр окрашивающего раствора с предварительно подогретым буфером Кребса.

Затем оберните трубку фольгой, чтобы свести к минимуму воздействие света, и поддерживайте ее на уровне 37 градусов по Цельсию. После стимуляции ацетилхолином перенесите кольца аорты из органной ванны в пробирку с окрашивающим раствором и дайте им инкубироваться в течение 30 минут в темноте с аэрацией. Все шаги с этого момента должны выполняться с минимальным воздействием света.

Далее перенесите кольца аорты в новую трубку, заполненную буфером Кребса на минуту. Выполните этот этап стирки три раза. Затем зафиксируйте кольца аорты в ванне с 4% раствором параформальдегида на 30 минут при комнатной температуре.

После этапа фиксации перенесите кольца в раствор DAPI на три минуты при комнатной температуре, чтобы нанести противопятно. Затем промойте кольца аорты PBS три раза по одной минуте за промывку. Всегда будьте чувствительны к хрупкости эндотелиальной ткани при перемещении колец.

Под микроскопом разрежьте кольца аорты в продольном направлении микрохирургическими ножницами на предметном стекле. Затем удалите излишки жидкости с аорты, сохраняя ее влажной. Прижмите свернутые аорты к предметному стеклу эндотелием вниз на предметном стекле с помощью двух микрохирургических щипцов.

При этом не двигайте аорты вперед и назад. Этот шаг очень критичен, но не прост в эксплуатации. Лучше хорошо потренироваться перед формальным экспериментом.

Затем опустите монтажный материал на аорту. Накройте горку и заклейте ее лаком для ногтей. После сушки на воздухе в темноте визуализируйте предметные стекла с помощью конфокальной микроскопии.

Используйте скорость сканирования 200 герц, разрешение 1024 x 1024 пикселей и размер z-стека в четверть микрона. Для наблюдения DAF-2DA используйте аргоновый лазер, установите флуоресценцию возбуждения на 488 нанометров, а детектор излучения — на 515 нанометров. Чтобы наблюдать DHE, установите флуоресценцию возбуждения на 514 нанометров и установите детектирование на 605 нанометров.

После фокусировки на 10-кратное увеличение отрегулируйте объектив до 40-кратного увеличения. Теперь определите диапазон эндотелиального слоя, отрегулировав положение z на панели управления, используя ядра, окрашенные DAPI, в качестве ориентиров. Затем просканируйте эндотелиальный слой на границе просвета по всей толщине эндотелиального слоя и запишите изображения.

Отсканируйте не менее трех различных полей зрения для каждого образца. Молодые мыши C57 black 6 страдали ожирением, получая пищу с высоким содержанием жиров в течение 14 недель. Контрольную группу кормили обычным чау-чау.

Через 14 недель их грудные артерии были обследованы. Перед окрашиванием ткани подвергали воздействию ингибитора eNOS L-NAME в течение часа на одном наномоляре. Сигнал от DAF-2T, видимый зеленым цветом, преобразуется из нефлуоресцентного DAF-2 оксидом азота.

Таким образом, окрашивание предполагает наличие оксида азота в клетке. Точно так же, при окислении супероксидом, DHE излучает красный флуоресцентный сигнал. Таким образом, образцы, показывающие более красный цвет, имеют больше супероксида в клетках.

Количественная оценка конфокальных флуоресцентных изображений выявила снижение продукции оксида азота и увеличение выработки чувствительного к L-NAME супероксида в эндотелиальном слое аорты у мышей, получавших пищу с высоким содержанием жиров. Эти данные подтверждают мнение о том, что разъединение eNOS происходит при ожирении. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как обнаружить оксид азота и супероксидные анионы, а также как использовать флуоресцентные красители в неповрежденных кровеносных сосудах.

После освоения этой техники ее можно выполнить за шесть часов, если она выполнена правильно. Приступая к этой процедуре, важно помнить о том, что эндотелиальный слой должен оставаться в такте на протяжении всей процедуры операции. И всегда погружайте кровеносные сосуды в буфер Кребса-Рингера, чтобы сохранить эндотелиальные клетки живыми до этапа фиксации.

В сочетании с этой процедурой можно проводить и другие мероприятия, такие как анализ вазомоторных реакций кровеносных сосудов, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как физиологическая функция эндотелиальных клеток в регулировании сосудистого тонуса.