Количественный Glycomics и протеомикс Комбинированная стратегия очистки

Общая цель этого рабочего процесса, основанного на использовании одного фильтра, заключается в том, чтобы легко и количественно очистить N-гликаны и белки в тандеме из биологических образцов масс-спектрометрического анализа. Масштабируемость, скорость и аналитическая воспроизводимость этого метода делают его непосредственно доступным с точки зрения ресурсов и навыков для лабораторий биологической масс-спектрометрии. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет исследователям одновременно исследовать вопросы гликомики, занятости сайтов гликозилирования и протеомики в крупномасштабных биологических исследованиях с высокой пропускной способностью.

Мы преодолели трудности, связанные с измерениями N-гликанов, объединив этот метод со стратегией деривации, адаптированной для масс-спектрометрии, что привело к точной, относительной количественной оценке между раком и контрольными состояниями. При снижении аналитической вариабельности могут быть выяснены новые биологические взаимодействия между гликомом и протеомом, что дает ключевые сведения о болезненных состояниях и открывает новые возможности для открытия биомаркеров. Для начала загрузите 2,5 микролитра плазмы на фильтр.

Затем добавьте 2 микролитра 1М раствора дитиотреитола в каждый образец в фильтре. Разбавьте образец 200 микролитрами 100-мМ буфера для расщепления бикарбоната аммония PNGase. Закройте пробирку с образцом фильтра и слегка закройте его вихрем, стараясь не потревожить фильтр с его посадочного места.

Инкубируйте образец при температуре 56 градусов Цельсия в течение 30 минут, чтобы денатурировать белки и гликопротеины. Чтобы алкилировать образцы, добавьте 50 микролитров 1М йодоацетамида, чтобы получить конечную концентрацию примерно 200 мМ. Затем инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 60 минут.

Сконцентрируйте денатурированный гликопротеин на фильтре, центрифугируя образцы при давлении 14 000 x g в течение 40 минут, прежде чем отбросить проточный поток. Промойте образец 100 микролитрами буфера для расщепления PNGase. Сконцентрируйте гликопротеин на фильтре и выбросьте проточный.

Повторите шаг промывки и концентрации дважды, в общей сложности три раза, в результате чего концентрат окажется в мертвом объеме фильтра. Выбросьте всю проточную и сборную пробирку после завершения стирки. Затем добавьте в фильтр 2 микролитра безглицеринового пептида N-гликозидазы F или PNGазы F после пересадки в свежий флакон для сбора.

Добавьте 98 микролитров буфера для расщепления PNGase, доведя общий объем до 100 микролитров, и аккуратно пипетируйте вверх и вниз по фильтру для перемешивания. Для ускорения скачка в сбраживании инкубируйте образцы при температуре 50 градусов Цельсия в течение 2 часов. Работая быстро, удалите образцы и добавьте еще 2 микролитра PNGазы без глицерола F. Слегка перемешайте образцы в течение 1-2 секунд.

Инкубируйте образцы при температуре 50 градусов Цельсия еще 2 часа. После того, как гликаны ускользают от гликанов путем центрифугирования образца при температуре 20 градусов Цельсия, добавьте 100 микролитров буфера для расщепления PNGазы в фильтр и снова центрифугируйте. Соберите смывку, содержащую остатки N-связанного гликана, в той же пробирке для сбора, что и элюент.

Повторив дважды, снимите фильтр и поместите в новый коллекционный флакон для подготовки протеомики. Затем инкубируйте образцы гликана в морозильной камере при температуре 80 градусов Цельсия в течение 30-60 минут до замерзания. Затем просушите до полной сушки при комнатной температуре в вакуумном концентраторе в течение 4-6 часов.

Промойте фильтр, содержащий деанимированные пептиды, 400 микролитрами 8М буфера мочевины. Закупорьте коллекцию флаконом и слегка перемешайте. Сконцентрируйте пептиды на фильтре, прежде чем отбросить весь поток.

Повторив промывку буфера мочевины еще дважды, промойте фильтр, содержащий деанимированные пептиды, буфером для расщепления Трипсина. Закройте флакон для сбора и слегка перемешайте, прежде чем снова сосредоточиться на фильтре, как и раньше. Отбросьте весь поток и повторите еще 2 раза, чтобы получить в общей сложности 3 промывки буфера для расщепления трипсина.

Соберите все будущие элюенты и смывки в новый флакон для коллекции. Затем добавьте 50 микролитров модифицированного свиньей трипсина в соотношении трипсина к белку 1:50 для исследовательской протеомики или 1:5 соотношения трипсина к белку для количественных экспериментов по протеомике. Закупорьте коллекцию флаконом и слегка перемешайте.

После инкубации образцов при температуре 37 градусов Цельсия в течение 2 часов быстро удалите образцы и добавьте еще 50 микролитров трипсина при соответствующем соотношении трипсина и белка. Слегка перемешайте образцы в течение 1-2 секунд. Затем инкубируйте при температуре 50 градусов Цельсия в течение дополнительных 2 часов.

После элюирования пептидов центрифугированием, как и раньше, в течение 20 минут, промойте оставшиеся пептиды из фильтра с помощью буфера Quench. Отключите фильтр центрифугированием, как и раньше, в течение 15 минут. После количественного определения концентрации пептидов в образцах инкубируйте образцы пептидов в морозильной камере при температуре 80 градусов Цельсия до замерзания.

Затем просушите до полной сушки при комнатной температуре в вакуумном концентраторе в течение 4-6 часов. Затем триптические белки непосредственно перед жидкостной хроматографией, масс-спектрометрией или LCMS анализом в подвижной фазе А до желаемой концентрации. Концентрации триптических пептидов от 2,5 микролитров в плазме колеблются от 100 до 300 нанограмм на микролитр.

Перед анализом гликанов восстановите высушенные стабильные изотопные меченые 4-фенэтилбензогидразидные реагенты, а также нативные реагенты P2GPN в одном миллилитре деривационного раствора до конечной концентрации 0,25 мг на миллилитр. Для полного растворения реагентам потребуется до 10 минут. Экстенсивный вихрь для обеспечения полной растворимости.

Пометьте высушенные N-гликаны 200 микролитрами меченного стабильными изотопами или нативного реагента P2GPN. Пипеткой вверх и вниз, чтобы снова суспендировать высушенные гликаны. Затем нанесите образцы в вихревое состояние и вращайте в течение примерно 5 секунд на настольной центрифуге.

Вступайте в реакцию гликанов с реагентом в течение 3 часов при температуре 56 градусов Цельсия. Немедленно перенесите гликаны из инкубатора в вакуумный концентратор и высушите до полного нагрева при температуре 55 градусов Цельсия в течение 3-5 часов. Повторно суспендируйте меченый N-гликан в 25-50 микролитрах воды непосредственно перед жидкостной хроматографией и масс-спектрометрическим анализом.

Проводите пипетку вверх и вниз, чтобы обеспечить полную растворимость N-гликанов. После центрифугирования образцов, как и раньше, в течение 5 минут удалите надосадочную жидкость, стараясь не допустить касания кончиком пипетки дна пробирки центрифуги. Объедините пару образцов, помеченных нативными и стабильными изотопами, в соотношении 1:1 для тандемного анализа относительной количественной оценки.

Подготовьте 2 различных метода LCMS для рабочих процессов протеомики и гликомики. Для анализа белка введите примерно 400 нанограммов белка в колонку с NPA. Прогоните образец со скоростью 300 нанолитров в минуту с уравновешиванием предварительной колонки 1 микролитр и аналитическим уравновешиванием колонки 5 микролитров.

Ионизируйте белки в условиях МС, предусмотренных в текстовом протоколе. Для анализа гликанов введите в колонку 5 микролитров повторно суспендированных образцов нативных и меченных стабильными изотопами образцов экви-М, меченных P2GPN. Прогоните образец со скоростью 300 нанолитров в минуту с уравновешиванием предварительной колонки 2 микролитра и аналитическим уравновешиванием колонки 5 микролитров.

Затем ионизируйте гликаны в условиях МС, указанных в текстовом протоколе. Протокол очистки на основе фильтра сравнивали со стандартным методом твердофазной экстракции, и содержание гликанов в плазме, обнаруженных между двумя протоколами, существенно не отличалось. В обоих методах одни и те же гликаны обнаруживаются вблизи предела обнаружения, где вариабельность увеличивается.

Оценивалась взаимоизменчивость эквиМ-смесей плазмы, очищенной по протоколу фильтрации или стандартному протоколу твердофазной экстракции. Оба протокола имели гауссовы распределения, средние значения которых существенно не отличались от нуля. 80 процентов гликанов подверглись двукратному изменению.

Молекулярно-массовые распределения гликанов, обнаруженные в новых и традиционных протоколах очистки, существенно не отличались и охватывали один и тот же диапазон. Качественно смещения между гликанами не наблюдалось. Белки плазмы готовили с помощью стандартной пробоподготовки с помощью фильтрации и нескольких встроенных протоколов.

Количество идентифицированных белков было одинаковым для различных протоколов. Неспецифическая деамидация контролировалась в протоколах микроволнового разложения и спайкового несварения желудка до менее чем 10 процентов. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что точная заполняемость участка гликозилирования зависит от минимизации тепла и временного воздействия.

После освоения очистка N-гликана в строке пекурикена может быть завершена за 2 дня. Следуя этой процедуре, можно интегрировать и смоделировать точное количественное определение белка N-гликана и занятость сайта гликозилирования с использованием статистических методов более высокого порядка. Этот метод дает возможность быстро считывать сложный язык, на котором говорит биология рака, количественно сравнивать различия в белковой терапии и по-настоящему раскрывать важность гликозилирования в биологическом контексте.