Выделение, характеристика и функциональное обследование сотовый сети десен иммунной

Общая цель этого метода заключается в выделении иммунных клеток десны для углубленной характеристики иммунных реакций, связанных с оральным иммунитетом и пародонтитом. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области орального иммунитета, например, какие клеточные факторы участвуют в патогенезе пародонтита. Основные преимущества этого метода заключаются в том, что он позволяет оценить сеть оральных иммунных клеток и выделить достаточное количество жизнеспособных клеток для последующих исследований in vitro.

В качестве первого шага этого протокола начните с установки штифтов для обездвиживания тела мыши и открытия грудной и брюшной полостей для обнажения сердца и внутренних органов. Затем сделайте разрез в полой вене и с помощью 3-миллилитрового шприца, оснащенного иглой 27-го калибра, введите 3 миллилитра PBS через левый желудочек. Когда вся кровь будет смыта, прикрепите голову мыши к диску для препарирования животом вверх.

Затем с помощью ножниц разрежьте каждую спайку губы по направлению к шее, отделяя кожу, покрывающую нижнюю челюсть и область шеи, и обнажая нижележащие ткани и мышцы. Разрежьте между нижними резцами, чтобы отделить обе стороны нижней челюсти. Иммобилизуйте каждую сторону отделенной нижней челюсти иглами 25-го калибра, чтобы получить доступ к полости рта.

После определения нёба с помощью хирургического лезвия No 10 сделайте вертикальные разрезы прямо перед первым моляром и сзади третьего моляра. Затем рассеките ткани в сторону от носовой полости, а также рассеките блоки от нижней челюсти. Затем удалите лишнюю ткань с границы десны и перенесите верхнечелюстной и нижнечелюстной блоки в 50-миллилитровую коническую трубку, содержащую 5 миллилитров коллагеназы и ДНКазы на льду.

Переваривайте ткань в шейкерном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа, добавляя 50 микролитров 0,5 моляра ЭДТА в течение последних пяти минут. Затем добавьте к тканям 5 миллилитров холодной ДНКазной среды, и аккуратно перемешайте содержимое тюбика, перемешивая его. Затем переложите четыре блока ткани в чашку Петри.

И залейте их 500 микролитрами свежей ДНКазной среды. С помощью скальпеля удалите десну из каждого блока ткани. И переложите все содержимое чашки в ситечко 70 микрон на вершине 50-миллилитровой трубки.

Вымойте чашку Петри и ситечко от 3 до 5 миллилитров свежей среды ДНКазы. А затем с помощью поршня стерильного 3-миллилитрового шприца разомните десневые ткани о сетку ситечка. Промойте фильтр 30-35 миллилерами холодной среды ДНКазы и центрифугируйте фильтрат.

Затем ресуспендируйте нёбо в 1 миллилитр полной среды, и определите количество жизнеспособных клеток. Выделение и обработка иммунных клеток, как только что было продемонстрировано, дает достаточное количество клеток для проведения стимуляции ex-vivo и характеристики паттернов секреции цитокинов десневых клеток как у диких животных, так и у животных, восприимчивых к пародонтиту. Действительно, состав иммунных клеток десны мыши может быть проанализирован, как показано на этих графиках плотности, оценивающих т- и естественные компартменты клеток-киллеров у мышей, чувствительных к пародонтиту с нокаутом LFA.

Используя соответствующие стратегии гейтирования, также можно определить внутриклеточную продукцию цитокинов TCR бета CD4 положительных, TCR бета CD8 положительных и TCR гамма дельта положительных Т, а также NK и врожденных лимфоидных клеток. После освоения клетки могут быть изолированы за три часа для иммуноокрашивания, если техника выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что все шаги должны выполняться эффективно и быстро, удерживая клетки на льду, когда они не подвергаются манипуляциям.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как сортировка клеток, чтобы ответить на дополнительные вопросы, связанные с функцией конкретных подмножеств клеток.