Выделение, характеристика и функциональное обследование сотовый сети десен иммунной
16 февраля 2016 г.
Мы создали методику выделения, фенотипического описания и функционального анализа иммунных клеток из мышиного десны.
Общая цель данного метода заключается в выделении иммунных клеток десны для углубленной характеристики иммунных ответов, связанных с иммунитетом полости рта и периодонтитом. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунитета полости рта, такие как определение клеточных факторов, участвующих в патогенезе периодонтита. Основными преимуществами данной методики являются возможность оценки сети иммунных клеток полости рта и выделение достаточного количества жизнеспособных клеток для последующих исследований in-vitro.
В качестве первого шага данного протокола закрепите тело мыши булавками и вскройте грудную и брюшную полости, чтобы открыть доступ к сердцу и внутренним органам. Затем сделайте разрез в полой вене и с помощью 3-миллилитрового шприца с иглой 27G введите 3 мл PBS через левый желудочек. После полного вымывания крови зафиксируйте голову мыши булавками на препарировочном коврике животом вверх.
Затем с помощью ножниц сделайте разрезы от каждого угла рта в направлении шеи, отделяя кожу, покрывающую область нижней челюсти и шеи, чтобы обнажить подлежащие ткани и мышцы. Сделайте разрез между нижними резцами, чтобы разделить обе стороны нижней челюсти. Иммобилизируйте каждую сторону разделенной нижней челюсти иглами калибра 25 G для обеспечения доступа к ротовой полости.
После идентификации неба с помощью хирургического лезвия № 10 сделайте вертикальные разрезы непосредственно кпереди от первого моляра и кзади от третьего моляра. Затем отделите ткани от полости носа, а также отделите блоки от нижней челюсти. После этого удалите избыточные ткани с края десны и перенесите блоки верхней и нижней челюстей в коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую 5 мл коллагеназы и ДНКазы на льду.
Проведите переваривание ткани в шейкере-инкубаторе при 37 °C в течение одного часа, добавив 50 µL 0,5 M EDTA в течение последних пяти минут. Затем добавьте к тканям 5 mL холодного раствора DNase и осторожно перемешайте содержимое пробирки круговыми движениями. После этого перенесите четыре блока ткани в чашку Петри.
Затем накройте их 500 µL свежей среды с DNase. С помощью скальпеля удалите десну из каждого блока ткани. Перенесите все содержимое чашки в клеточный фильтр с размером пор 70 мкм, установленный на 50-миллилитровой пробирке.
Промойте чашку Петри и сито 3–5 миллилитрами свежей среды с ДНКазой. Затем с помощью поршня стерильного шприца объемом 3 миллилитра разотрите десневую ткань о сетку сита. Промойте сито 30–35 миллилитрами холодной среды с ДНКазой и центрифугируйте фильтрат.
Затем ресуспендируйте осадок в 1 миллилитре полной среды и определите количество жизнеспособных клеток. Изоляция и обработка иммунных клеток, продемонстрированные выше, позволяют получить достаточное количество клеток для проведения стимуляции ex-vivo и характеристики профилей секреции цитокинов клетками десны как у животных дикого типа, так и у животных, восприимчивых к периодонтиту. Состав иммунных клеток десны мыши может быть проанализирован, как показано на данных графиках плотности, при оценке популяций T-клеток и натуральных киллеров у нокаутных по LFA мышей, восприимчивых к периодонтиту.
Используя соответствующие стратегии гейтирования, можно также определить внутриклеточную продукцию цитокинов Т-клетками TCR-beta CD4+, TCR-beta CD8+ и TCR-gamma delta+, а также NK-клетками и врожденными лимфоидными клетками. После освоения метода клетки могут быть изолированы для иммуноокрашивания за три часа при условии правильного выполнения техники. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости эффективно и быстро завершать все этапы, поддерживая клетки на льду в те моменты, когда с ними не производятся манипуляции.
После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, например, сортировку клеток, чтобы ответить на дополнительные вопросы, касающиеся функций конкретных субпопуляций клеток.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен метод выделения и характеристики иммунных клеток из десны мыши. Метод направлен на углубление понимания механизмов орального иммунитета и пародонтита.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Биология полости рта
- Периодонтология
Теоретическая часть
- Понимание иммунных ответов в ротовой полости имеет решающее значение для лечения заболеваний пародонта.
- Иммунные клетки десны играют значительную роль в иммунитете полости рта.
- Существующие методы могут не обеспечивать достаточного количества жизнеспособных клеток для детального анализа.
- Данная методика направлена на устранение этого пробела, позволяя проводить углубленные функциональные исследования.
Цель исследования
- Изолировать иммунные клетки десны для их последующей характеристики.
- Изучить клеточные факторы, участвующие в патогенезе периодонтита.
- Оценить сеть иммунных клеток полости рта.
Используемые методы
- Иммобилизация мыши и обнажение внутренних органов.
- Разрез полой вены для промывания крови.
- Использование шприца для перфузии PBS через левый желудочек.
- Подготовка мыши к дальнейшему анализу.
Основные результаты
- Успешное выделение жизнеспособных иммунных клеток десны.
- Характеристика иммунных ответов, связанных со здоровьем полости рта.
- Представления о патогенезе периодонтита.
- Потенциал для последующих исследований in-vitro.
Выводы
- Этот метод представляет собой ценный инструмент для изучения иммунитета полости рта.
- Он позволяет лучше понять динамику иммунных клеток в тканях десны.
- Будущие исследования могут использовать данный метод для более глубокого изучения заболеваний пародонта.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Точное выделение и функциональный профилинг иммунных клеток десны позволяют снизить механические риски в оральной иммунологии и способствуют валидации мишеней для исследований воспалительных заболеваний. Данный рабочий процесс позволяет получать популяции клеток с высокой жизнеспособностью для количественного фенотипирования и функциональных анализов ex vivo, что повышает прогностическую достоверность на ранних этапах поиска и в трансляционных исследованиях. Этот подход предназначен для принятия решений по портфелю исследований и разработок в области иммунологии и здоровья полости рта, обеспечивая возможность надежного изучения резидентных иммунных сетей тканей.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать субпопуляции иммунных клеток, участвующих в патогенезе воспаления полости рта.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней с помощью анализов секреции цитокинов ex vivo.
- Способствует снижению механистических рисков за счет уточнения вклада иммунных клеток в модели заболевания.
- Предоставляет количественные данные для приоритизации портфеля разработок на основе гипотез.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает получение жизнеспособных, фенотипически охарактеризованных иммунных клеток для последующей разработки анализов.
- Поддерживает воспроизводимую подготовку биологических образцов для стандартизированных рабочих процессов скрининга.
- Позволяет получать количественные показатели иммунной функции для оценки соединений.
- Повышает масштабируемость и готовность анализов для платформ высококонтентного скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет профилирование иммунных клеток с релевантными моделями заболеваний полости рта для обеспечения трансляционной преемственности.
- Обеспечивает поиск функциональных биомаркеров в доклинических исследованиях иммунопатологии полости рта.
- Поддерживает обоснованное с учетом рисков развитие иммуномодулирующих стратегий, направленных на ткани полости рта.
- Предоставляет понимание механизмов для информированного отбора доклинических кандидатов.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод встраивается в континуум от этапа открытия до доклинических исследований, обеспечивая получение высококачественных препаратов иммунных клеток как для механистических исследований, так и для функционального скрининга в моделях заболеваний полости рта.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез о роли иммунных клеток в гомеостазе и патологии тканей полости рта.
- Скрининг: обеспечивает получение воспроизводимых жизнеспособных популяций клеток для разработки методов анализа и тестирования соединений.
- Аналитика: позволяет проводить количественное измерение секреции цитокинов и фенотипов иммунных клеток для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: позволяет связать результаты фундаментальных исследований с доклинической валидацией на релевантных моделях заболеваний полости рта.
- Корпоративное повторное использование: устанавливает стандартизированный рабочий процесс, адаптируемый к различным программам исследований в области иммунологии полости рта.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность в исследованиях иммунитета полости рта.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизированную, воспроизводимую и масштабируемую изоляцию иммунных клеток для обеспечения сопоставимости результатов различных исследований.
- Стратегическая ценность: способствует принятию обоснованных решений о продолжении или прекращении разработок (go/no-go) и капиталоэффективному продвижению активов в области оральной иммунологии.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритезацию мишеней и подходов в пайплайнах оральной и слизистой иммунологии с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в препарировании мышей и работе с иммунными клетками.
- Необходим доступ к оборудованию для проточной цитометрии и инфраструктуре для проведения функциональных анализов ex vivo.
- Необходима стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости выделения и анализа клеток.
- Адаптация метода для других слизистых тканей может потребовать оптимизации протокола.
- Жизнеспособность и выход клеток зависят от соблюдения временных интервалов и температурного режима при выполнении процедур.
