Стандарты для количественного анализа с использованием Metalloproteomic гельпроникающей ICP-MS

Общая цель этого метода заключается в том, чтобы иметь возможность количественно определять различные металлопротеины в сложных стандартах на основе использования известных стандартов металлопротеинов. Этот метод может ответить на ключевые вопросы о роли металлов в биологии. Например, как меняется металлический статус белка при заболевании?

Ключевым преимуществом этой методики является то, что она позволяет измерить металлический статус белка в его нативном состоянии. Демонстрировать эту технику будет Эмбер Лотиан, аспирантка из моей лаборатории. Для начала гомогенизируйте образцы тканей или клеточных культур путем ручного опускания или ультразвуковой обработки в течение пяти минут с использованием трис-буферного физиологического раствора.

Осветите гомогенаты центрифугированием при температуре 16 000 раз G в течение пяти минут. После сбора полученной надосадочной жидкости нормализуйте общее количество белка, определив концентрации белка, как описано в текстовом протоколе. Прогрейте и настройте маспектрометр с индуктивно связанной плазмой, используя протоколы производителя.

Разбавьте нормы металлопротеина, чтобы насладиться падением в диапазоне от нуля до 500 микрограммов на литр, используя один процент азотной кислоты. Чтобы достичь стандартов в этом диапазоне, не используйте разведения, превышающие один и 20. Установите порядок впрыскиваний, сначала проанализировав семь калибровочных уровней.

Концентрации варьируются от нуля до 500 микрограмм на литр, за которыми следуют нормы металлопротеина. Семь калибровочных уровней: ноль, один, пять, десять, 50, 100 и 500 микрограмм на литр. Далее выделите интересующие элементы.

Здесь используют железо, медь, цинк, кобальт и йод. Так как именно они являются элементами, с которыми связаны стандарты белка. Выберите элементы в методе сбора, открыв вкладку выбора элементов и добавив элементы и их соответствующие изотопные массы, которые необходимо анализировать.

Затем проведите анализ образца с помощью прибора. Программное обеспечение прибора автоматически создает калибровочные кривые для каждого из анализируемых элементов. Используйте калибровочные кривые для определения концентрации металла в неизвестных образцах.

На основе результатов объемного анализа сгенерировать стандарты металлопротеинов, включающие три наиболее распространенных микроэлемента в тканях млекопитающих, используя смесь меди, супероксиддисмутазы цинка и ферритина. Продуйте насосы для быстрой хроматографии или ВЭЖХ с помощью 200 миллимолярного буфера аммиачной селитры в течение пяти минут со скоростью потока пять миллилитров в минуту. После продувки системы установите скорость потока на нулевой отметке один миллилитр в минуту.

И подключите боковую колонку исключения. Подключите противоположный конец колонки к УФ-детектору, установите поглощение меры на уровне 280 нанометров, используя пиковые трубки. Постепенно увеличивайте расход колонны с шагом ноль целых один десятый миллилитр в минуту, пока не будет достигнут конечный расход в ноль целых четыре целых миллилитра в минуту.

Пока это происходит, проверьте соединения трубок с колонной на наличие утечек. Контролируйте давление в этой системе, чтобы убедиться, что оно не превышает требования к колонке, наблюдая за кривой давления на хроматограмме в программном обеспечении. Оставьте колонну уравновешиваться при требуемом расходе в течение пяти-10 объемов колонны.

он будет уравновешен, подключите приборы, чтобы можно было провести анализ образца. Настройте метод ВЭЖХ для откачки буфера А над колонной со скоростью ноль целых четыре миллилитра в минуту в течение 15 минут. Переведите ICPMS в режим ожидания перед изменением настроек оборудования.

Перейдя в режим ожидания, отключите связь для автоматического сэмплера и измените введение образца на другое. Используйте трубку PEEK для подключения потока из УФ-детектора непосредственно к небулайзеру на ICPMS. Включите ICPMS и дайте инструменту прогреться в течение 10–20 минут.

После того как плазма воспламенится, подключите дистанционный кабель от ICPMS к задней части автоматического пробоотборника ВЭЖХ. Сделайте это после того, как плазма воспламенится. В противном случае система ВЭЖХ автоматически отключится, так как ICPMS не включена.

Измените метод ICPMS для сбора данных для LC ICPMS, сначала изменив метод сбора данных со спектра на сбор данных с временным разрешением. Затем выберите элементы для анализа. Железо, медь, цинк, кобальт, йод, а также любые другие интересующие элементы, и задайте времена интегрирования.

После того, как интересующие вас элементы будут выбраны, отрегулируйте время сбора данных в соответствии со временем выполнения хроматографии. Ручная настройка ICPMS на чувствительность и скорость потока гелия в ячейке столкновений с помощью хроматографического буфера, протекающего с цезием и сурьмой, входящими в буфер. Как только количество ионов металлов стабилизируется, а относительные значения стандартного отклонения упадут ниже пяти процентов, система готова к использованию.

Создание образцов списков выполнения в программах ВЭЖХ и ICPMS. Список прогонов образцов содержит порядок, в котором должен быть введен каждый из образцов. А также название, под которым будут сохраняться данные.

Убедитесь, что общее количество выборок в списке совпадает между двумя программами. Запустите партию образцов для ICPMS до ВЭЖХ, так как введение образца с помощью ВЭЖХ приведет к тому, что ICPMS начнет сбор данных. Если это сделать не в правильном порядке, это приведет к отсутствию данных.

Создание точек калибровочной кривой путем введения различных объемов стандарта супероксиддисмутазы и ферритина. Объемы инъекций варьируются от одного микролитра до 30 микролитров. Наконец, проанализируйте каждый из неизвестных образцов, таких как ткань, плазма или клеточная культура, прежде чем анализировать данные, как описано в текстовом протоколе.

Показана иллюзия ферритина в диапазоне от 2000 до 60 000 пикограмм железа, впрыскиваемого на колонку. Регрессионный анализ проводили с использованием пиковой площади. Показаны профили иллюзий для меди, цинка, супероксиддисмутазы как для меди, так и для цинка.

Также показаны регрессионные анализы, полученные с использованием пиковых областей. Результаты регрессионного анализа используются для преобразования исходных данных в числах в секунду в пикограммы в секунду. Чтобы количество металла, связанного с белком, можно было определить количественно.

Этот метод может быть использован для идентификации металлопротеинов в сложных биологических образцах. Здесь показан человеческий мозг, разделенный с помощью SEC ICPMS. Каждый из них представляет собой отдельный металл, представляющий интерес.

А именно, медь, цинк или железо. Здесь показаны следы, полученные при воздействии этого метода на человеческую плазму. Сложность и распространенность образца будут влиять на количество наблюдаемых пиков.

Как и ожидалось, в плазме преобладают несколько металлопротеинов, в том числе церулоплазмин и трансферрин. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как настроить прибор, чтобы измерить нативное состояние металлопротеинов в сложных образцах. После освоения этой техники ее можно успешно применять уже через три-четыре часа.

Это позволяет анализировать от 20 до 36 образцов за один день. При попытке выполнить эту процедуру важно использовать соответствующие стандарты металлопротеинов, такие как медь и цинк, если вас интересуют медь и цинк. А также внутренние эталоны в буфере, такие как цезий, который позволяет корректировать любой дрейф прибора с течением времени.

Следуя этой процедуре, вы также можете реализовать другие формы масс-спектрометрии, чтобы ответить на важные вопросы. Например, какие металлопротеины присутствуют в моем образце? Это может быть сделано с помощью стандартных трипов в пищеварении и массового секвенирования белковых пептидов.

Или, анализируя белки в такте, в их нативном состоянии. После его разработки этот метод может проложить путь исследователям в области протеомики к пониманию роли металлопротеинов в таких заболеваниях, как болезнь Альцгеймера. Не стоит забывать и о работе с концентрированной азотной кислотой, и о клинических образцах.

Следует носить соответствующие средства индивидуальной защиты.