RNAi Trigger поставки в

Общая цель данного метода заключается в доставке триггеров РНК-интерференции в организм Anopheles gambiae для инициации нокдауна генов, начинающегося на стадии куколки. Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии переносчиков и выявить гены, которые играют важную роль на стадиях развития до достижения взрослого состояния или на ранних этапах имаго. Основным преимуществом данной техники является предоставление исследователям возможности проводить экспресс-анализы функциональной геномики, начиная нокдаун генов в период развития, соответствующий стадии куколки, для которой ранее не было разработано протоколов инъекционного введения РНК-интерференции.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы инъекции может быть трудно освоить из-за требуемой точности и хрупкости куколок на данной стадии развития. После выбора интересующего гена определите участок длиной от 200 до 800 пар оснований, который, по прогнозам, не будет вызывать побочных эффектов, и проведите стандартную ПЦР-амплификацию для получения матрицы синтеза двухцепочечной РНК, фланкированной последовательностью промотора T7. Затем синтезируйте двухцепочечную РНК и очистите продукты с помощью коммерческого набора для синтеза in vitro.

Доведите конечную концентрацию РНК до 3 µg/µL. Затем используйте стандартный 2%-ный агарозный гель, чтобы сравнить 0,5 µL двухцепочечной РНК с матричной ДНК и стандартными маркерами. После завершения электрофореза проверьте качество и длину полосы двухцепочечной РНК.

Видимые неспецифические продукты должны отсутствовать. Двуцепочечная РНК будет мигрировать медленнее, чем матричная ДНК. Для хранения подготовьте аликвоты двуцепочечной РНК и храните их при температуре -20 °C.

Начните с подготовки красителя Fast Green FCF. Сначала разведите краситель до концентрации 0,1% (объем/объем) в воде, свободной от РНказы. Затем перенесите по 1 µL полученного раствора в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл.

Нагрейте заполненные пробирки при 65 °C в течение примерно трех часов для испарения воды. Затем охлаждайте пробирки не менее 30 минут перед использованием сухих красителей. Далее изготовьте вытянутые стеклянные инъекционные иглы из боросиликатных стеклянных трубок.

Настройте вытягиватель игл для получения диаметра кончика от 10 до 30 микрон. Для вытягивателя капилляров NARISHIGE установите температуру первого нагревателя на 100, а второго — на 70. Затем зажмите капиллярную иглу и приступите к вытягиванию.

Теперь подготовьте станцию для инъекций. Выберите платформу, которую можно легко перемещать под микроскопом. Сначала закрепите на платформе с помощью скотча слой плотной фильтровальной бумаги.

Затем поверх плотной фильтровальной бумаги закрепите лентой один лист тонкой фильтровальной бумаги. Далее в пробирки с сухим красителем добавьте по 10 µL каждой двухцепочечной РНК, предназначенной для инъекции, и ресуспендируйте краситель. Храните эти пробирки на льду.

Теперь соберите куколок для инъекций. Налейте в чашку Петри диаметром 60 мм 10 мл деионизированной воды и с помощью пластической переносной пипетки перенесите в чашку около 50 светлоокрашенных куколок. Используйте только слабопигментированных особей, так как куколки, достигшие среднего или темного уровня дубления, подвергнутся повреждению кутикулы и будут иметь низкую выживаемость.

Первым этапом микроинъекции является подготовка иглы. Под микроскопом с помощью тонкого пинцета отломите самый дистальный кончик иглы. Затем заполните иглу минеральным маслом, используя шприц с иглой 30G.

После заполнения удалите излишки масла с помощью микроинъектора. Настройте микроинъектор на забор объемов по 69 нанолитров. Затем заполните иглу спереди подготовленной РНК для инъекции.

Проверьте дозирование двухцепочечной РНК на наличие проблем. Основными источниками проблем являются засорение наконечника и недостаточно надежная фиксация игл. После подготовки инжектора выберите от одной до трех куколок и перенесите их на подложку из фильтровальной бумаги.

С помощью кисти расположите куколку так, чтобы был доступен дорсальный кутикульный слой. Надавив на бумагу, удалите излишки воды с поверхности куколки. Удерживая куколку неподвижно влажной кистью, введите иглу в дорсальную кутикулу между брюшком и грудью движением в направлении от переднего конца к заднему под углом примерно 30 градусов.

Затем введите один или два импульса двухцепочечной РНК в гемолимфу. Если инъекция прошла успешно, должно быть видно распространение красителя по всему телу. При инъекции куколки крайне важно, чтобы игла проколола только дорсальную часть кутикулы.

Если прокол иглой проходит сквозь вентральную кутикулу, на внешней поверхности куколки будет заметно скопление окрашенной жидкости или краситель перейдет на фильтровальную бумагу. В таких случаях куколку необходимо утилизировать. Если краситель не распределяется по всей гемолимфе, скорее всего, кончик иглы закупорен.

Слегка переместите наконечник и определите, произошел ли выход РНК и красителя. Если признаков выхода красителя нет, утилизируйте куколку. Затем оцените состояние кончика иглы и выполните еще одну инъекцию новой куколке.

После успешной инъекции куколки аккуратно освободите ее от иглы с помощью влажной кисти и переместите в чашку с водой, где она завершит свое развитие. Поместите чашку с инъецированными куколками в клетку или контейнер для комаров в обычных условиях выращивания. В качестве источника питания для взрослых особей обеспечьте глюкозу в 10% растворе (по массе к объему), пропитанном в ватном тампоне.

После выхода имаго сравните их с контрольной группой. Например, насекомых с двухцепочечной РНК к SRPN2 следует ежедневно обследовать на предмет образования псевдоопухолей. Для этого охладите имаго в течение двух-трех минут при температуре -20 °C, а затем переместите их на охлаждающую пластину при температуре 2 °C для осмотра.

После осмотра взрослых особей верните их в зону разведения насекомых в инсектарии. После освоения метода частота выхода имаго из инъецированных куколок составила около 70%. У части инъецированных куколок наблюдался частичный выход из куколочного панциря, что привело к гибели комаров. Задержки в темпах выхода имаго между инъецированными и неинъецированными комарами не наблюдалось, а воздействие инъекции не зависело от пола.

Через десять дней после выхода из куколок заметных изменений в выживаемости инъецированных комаров по сравнению с неинъецированным контролем не наблюдалось. В качестве положительного контроля использовали ингибитор сериновой протеазы SRPN2, а в качестве отрицательного контроля для инъекций двухцепочечной РНК — двухцепочечную LacZ. К третьему дню после выхода из куколок у взрослых особей, которым вводили двухцепочечную SRPN2, при исследовании с помощью световой микроскопии были обнаружены псевдоопухоли.

Спустя восемь дней псевдоопухоли стали очень заметны. У комаров на взрослой стадии развития меланотические псевдоопухоли наблюдались через кутикулу у большинства животных, которым ввели двухцепочечную РНК SRPN2, в то время как в контрольных группах псевдоопухоли отсутствовали. Через пять дней после инъекции уровни белка SRPN2 были значительно ниже у комаров, которым ввели двухцепочечную РНК SRPN2, по сравнению с контрольными группами, которым ввели двухцепочечную РНК LacZ, и неинъекционными контролями.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понять, как осуществлять доставку триггера РНК-интерференции в куколки Anopheles gambiae с использованием данного недавно разработанного протокола инъекций. Как правило, люди, которые только начинают осваивать этот метод, сталкиваются с трудностями из-за непредсказуемых движений куколки. Однако отработка правильного позиционирования и стабилизации куколки значительно повышает процент успешных инъекций, а также качество введения препарата.

После освоения техники на одну куколку требуется примерно 30 секунд. Разработка данного метода открывает исследователям в области биологии переносчиков возможность изучать и оценивать функцию генов на преимагинальных стадиях и ранних стадиях имаго у переносчика малярии Anopheles gambiae. После выполнения этой процедуры можно использовать другие методы, такие как вестерн-блоттинг или количественная ПЦР, для определения степени нокдауна целевого гена на уровне экспрессии белка или транскрипта соответственно.

В конечном счете этот метод поможет выявить гены, имеющие решающее значение для передачи паразитов комарами; данный подход позволит нам определить новые мишени и даст новое представление о том, как создавать более эффективные стратегии контроля переносчиков.