Использование Комбинированные методики для определения роли плазмалеммы доставкой в ​​Axon ветвление и морфогенеза нейронов

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы провести количественные наблюдения за временными и пространственными проявлениями фушионов и ветвлением аксонов нейрональных экзоцитарных везикул. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, например, когда и где слияние везикул встраивает мембранный материал в расширяющуюся плазматическую мембрану во время развития нейронов. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он сочетает в себе визуализацию живых клеток для получения как высокого, пространственного, так и временного разрешения в отдельных клетках и биохимические подходы для получения популяционной информации.

После культивирования и моделирования корковых нейронов с помощью Netrin-1 или контрольной группы согласно тексту протокола. Отсадите PBS из первой лунки кондиции и замените 250 микролитрами гомогенизационного буфера. Инкубируйте на льду в течение пяти минут, а затем с помощью клеточного подъемника гомогенизируйте клетки на льду.

Отсадите PBS из следующей лунки того же состояния и добавьте в лунку недавно гомогенизированную смесь, которая увеличит концентрацию белка. Затем переложите гомогенизированный раствор в предварительно охлажденную 1,6-миллилитровую микрофужную пробирку на льду и добавьте 20% Triton X-100 до достижения конечной концентрации 1%Затем с помощью пипетки объемом 1 000 микролитров разотрите смесь десять раз, сводя к минимуму образование пузырьков. Инкубируйте пробирки на льду в течение двух минут, чтобы растворить белки.

Затем центрифугируйте при температуре 6 010 RCF при 4 градусах Цельсия в течение 10 минут для гранулирования нерастворимого материала. Перенесите надосадочную жидкость в новую охлажденную 1,6-миллилитровую трубку на льду. Затем используйте анализ Брэдфорда для определения концентрации белка.

Затем используйте гомогенизационный буфер с 1% Triton X-100 и 5X буфер для образцов с добавлением BME для разбавления образцов до конечной концентрации 3-5 миллиграммов на миллилитр. Разделите каждый экспериментальный образец поровну на две пробирки. Затем инкубируйте один образец при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут, а другой при 100 градусах Цельсия в течение 30 минут.

Периодически переворачивайте пробирки, чтобы образцы оставались в растворе. Затем проведите SDS page и вестерн-блоттинг по текстовому протоколу. После настройки микроскопа TIRF и образца и нахождения нейрональной фокальной плоскости согласно текстовому протоколу.

Запустите программное обеспечение для лазера и подключитесь к программному обеспечению для управления лазером. Установите освещение на широкое поле и выберите объектив. Затем установите показатель преломления образца и отрегулируйте интенсивность лазера, сняв галочку TTL для лазера 491.

Оптимизация параметров визуализации важна при визуализации неповрежденных экзоцитарных везикул на полу, чтобы избежать дрейфа фокуса и фототоксичности при получении изображений с высоким соотношением сигнал/шум, достаточным для анализа. Установите ползунок на 100, а затем опустите его обратно до значения от 20 до 40. Затем перепроверьте TTL.

Далее снова сфокусируйтесь на образце в освещении проходящим светом. Затем в программном обеспечении для обработки изображений выберите лазерную подсветку 491 и откройте затвор. Поместите конденсор вверх дном на оптическую скамью, чтобы не поцарапать объектив.

Точно отрегулируйте точку фокусировки лазера на потолке и, сняв конденсор, центрируйте точку по центру диафрагмы с закрытым полем. Затем замените конденсатор и в программном обеспечении TIRF отправьте глубину проникновения до 110 нанометров. Затем переключитесь с широкоугольного освещения на режим освещения TIRF для получения изображений.

Теперь, используя широкоугольную эпифлуоресценцию, найдите флуоресцентные клетки, экспрессирующие VAMP2 через окуляры. Затем, чтобы уменьшить фотообесцвечивание и фототоксичность, отрегулируйте параметры изображения, чтобы максимизировать соотношение сигнал/шум и динамический диапазон, используя минимальное время экспозиции и интенсивность лазера. Установите непрерывную автофокусировку для каждой ячейки.

Затем получите набор таймлапс-изображений, сбор которых происходит каждые 0,5 секунды в течение пяти минут. Для стимулированного состояния Нетрина-1 в ламинарном проточном колпаке добавьте до конечной концентрации 500 нанограммов на миллилитр Нетрина-1 в чашку с клетками и верните чашку в инкубатор за один час до визуализации. Количественно оценить частоту экзоцитарных событий, нормализованных для каждой клеточной площади и времени.

В ImageJ откройте стеки изображений, перетащив файл в окно или выбрав Файл, Открыть, имя файла. Чтобы удалить стабильные флуоресцентные сигналы, которые не представляют события слияния везикул, используйте Изображение, Стек, Z Проект, Тип проекции Средняя интенсивность. Создание средней проекции по оси Z для всего стека.

Вычтите полученное среднее изображение из каждого изображения в таймлапсе с помощью Процесса, Калькулятора изображений, Изображения 1 вашего стека, Операции Вычитание изображения два. В результате получается вновь созданная проекция Z. Это позволит сделать акцент на экзоцитарных событиях.

Теперь на глаз подсчитайте экзоцитарные фушионные события, которые можно идентифицировать как пятна дифракционно ограниченных флуоресцентных сигналов, которые быстро диффундируют по мере диффундации флуорена VAMP2 в плазматической мембране. Выделите первое изображение с помощью команд «Изображение», «Настройка», «Порог» и отрегулируйте ползунок, пока не будет выделена вся ячейка. Затем в разделе «Анализ» выберите «Установить измерения» и проверьте область и отображаемую метку.

С помощью инструмента для трассировки палочкой установите пороговую площадь ячеек и нажмите M для измерения. Переносите собранные данные в таблицу в соответствии с текстовым протоколом. Через два дня in vitro поместите стеклянную дневную чашку для визуализации, содержащую нетрансфицированные нейроны, в предварительно нагретую влажную камеру окружающей среды.

Используйте микроскоп, оснащенный объективом six DX plan apochromat 1.4 NA DIC и конденсатором с высокой числовой апертурой для достижения наилучшего качества изображения и разрешения. Затем с помощью проходящего света отрегулируйте фокальную плоскость, чтобы найти нейроны через окуляры. Для получения изображений разветвления аксонов с помощью DIC правильная настройка подсветки холодника будет иметь решающее значение для оптимизации изображения и имеет решающее значение для получения анализируемых результатов.

Затем, когда интересующие вас нейроны находятся в поле зрения, используйте функцию сбора данных из нескольких областей в программном обеспечении для визуализации, чтобы найти и сохранить местоположения XYZ, по крайней мере, шести клеток. Теперь добавьте к итоговой концентрации 250 нанограммов на миллилитр Netrin-1 или другой интересующий фактор для моделирования клеток и нажмите кнопку «Начать многозонный захват». Последовательно получайте изображения в каждой позиции каждые 20 секунд в течение 24 часов.

Приостановка съемки и перефокусировка по мере необходимости. В программном обеспечении для обработки изображений просмотрите изображения, выбрав «Приложения», «Просмотреть многомерные данные» и откройте нужный файл. Определите стабильные ветви аксонов, которые сформировались во время сеанса визуализации.

Используйте инструмент Область трассировки для измерения устойчивой ветви аксона от основания аксона до кончика. После обработки нейронов нетрином и ботулотоксином и фиксации и иммуноокрашивания, и иммуноокрашивания на бета-3 туболин и актин согласно текстовому протоколу. Используйте инвертированный микроскоп для получения широкопольных эпифлуоресцентных изображений.

Откройте стек изображений в ImageJ и вручную проанализируйте ветвящуюся линию, сегментированную линию и обведите аксон, который определен как самый длинный нейрит, отходящий от сомы. С помощью Analyze, Tools, ROI Manager сохраните трассировку аксонов в качестве области интереса. Затем обведите и сохраните каждую ветвь аксона, которая определяется как нейрит длиной больше или равен 20 микрометрам.

Включайте в анализ только основные ветви. Здесь показан вестерн-блоттинг после завершения комплексного анализа SNARE с устойчивостью к SDS. Исследован на SNAP25, Syntaxin 1A и VAMP2.

Белки SNARE в комплексе, идентифицируемые мономеры показаны здесь. Здесь показан пример экзоцитарного события, опосредованного флуроеном VAMP2, происходящего с течением времени в корковом нейроне. Увеличенные вставки обозначают сому, ветвь аксона и конус роста аксона, что указывает на пространственную полезность этого анализа.

Круги взрывают одиночные события слияния экзоцитов, которые можно увидеть с помощью микроскопии TIRF. Эта покадровая ДВС-визуализация показывает стимулированное Нетрином формирование ветви аксона в режиме реального времени. Эти местоположения обозначают начальный выступ из участка ответвления.

Они представляют собой полностью сформированные устойчивые ветви размером не менее 20 микрометров, измеренные от главного аксона до кончика ветви. В этом эксперименте корковые нейроны в 3 DIV обрабатывались либо Netrin-1, который стимулирует ветвление, либо ботулиническим токсином А, который расщепляет SNAP25, компонент комплекса SNARE и блокирует экзоцитоз. Результаты показывают, что SNARE-опосредованный экзоцитоз необходим для нетрин-зависимого ветвления.

После освоения визуализация DIC может быть завершена за один сеанс визуализации за ночь. Визуализация отдельных экзоцитарных событий с помощью TIRF может быть выполнена в течение 4-5 часов. Протокол биохимии образования комплекса SNARE может быть выполнен за два часа.

Пытаясь выполнить эти процедуры, важно помнить о необходимости двигаться в нужном темпе и не торопиться ни с одним шагом. Каждая процедура требует внимания и терпения для достижения наилучших результатов. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как котрансфекция помеченных компонентов везикул с помеченными грузами-кандидатами, чтобы ответить на дополнительные вопросы.

Например, каков груз экзоцитарных везикул? После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области нейробиологии к изучению невритогенеза, ветвления аксонов и других стадий морфогеза в любой диссоциированной нейронной культуре. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как наблюдать и количественно оценивать пространственную и временную природу событий слияния нейронных экзоцитарных везикул, соответствующих изменениям в морфогенезе нейронов.

Не забывайте, что работа с ботулотоксином или мощными лазерами может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение надлежащей защитной одежды и использование механизма блокировки безопасности микроскопа.