Иммунное окрашивание фосфо-эпитопы в мерцательного органах вся гора эмбрионов данио

Общая цель этой процедуры заключается в иммунолокализации белков, которые активируются в эмбрионе данио-рерио. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области развития и клеточной биологии, такие как локализация и активация фосфорилированных белков в цельном эмбрионе. Основное преимущество этой методики заключается в том, что можно локализовать кальций-зависимую сигнализацию у целого эмбриона путем иммуноокрашивания белков, активированных кальцием.

После получения эмбрионов дикого типа или трансгенных в соответствии с текстовым протоколом добавьте 0,003% PTU к эмбрионам в воду системы для блокировки пигментации и инкубации до желаемой стадии развития. Когда эмбрионы достигнут нужной стадии, добавьте MESAB в блюдо, чтобы обезболить рыбу. Как только рыбы будут обезболиваться, удалите как можно больше системной воды, затем добавьте свежие 4% PFA и PBS и инкубируйте при комнатной температуре в течение трех-четырех часов.

После инкубации удалите PFA и используйте 100% метанол для его замены. Затем храните эмбрионы при температуре минус 20 градусов Цельсия не менее 48 часов. Чтобы провести иммуноокрашивание, поместите минимум 10 эмбрионов для каждого экспериментального условия в помеченные 1,5-миллиметровые микроцентрифужные пробирки.

Когда эмбрионы осядут на дно пробирки, удалите и выбросьте метанол и используйте прогрессивные промывки уменьшающейся концентрации этанола в PBTx для регидратации эмбрионов. Удалите последнюю жидкость для мытья PBTx и добавьте 0,5 миллилитра 10% обычной козьей сыворотки или NGS в PBTx. Затем инкубируйте при комнатной температуре не менее одного часа с легким покачиванием.

Затем удалите раствор и добавьте от 0,2 до 0,5 мл разведения 1 из 5 мышиного моноклонального антитела против ацетилированного тубулина и 10% NGS и PBTx. Инкубируйте эмбрионы при осторожном покачивании при комнатной температуре в течение ночи. Утром удалите и отбросьте антитела и выполните три полоскания с использованием 0,5 миллилитров 2%-ного NGS и PBTx с легким покачиванием в течение пяти минут каждое.

Приглушите верхний свет и добавьте 500 микролитров в каждый образец 1 к 500 разведению флуоресцентно конъюгированных вторичных антител в 10% NGS и PBTx. Инкубируйте в темноте при комнатной температуре в течение четырех часов с легким покачиванием. После инкубации промойте зародыши три раза.

Для совместного иммуноокрашивания добавьте 1 к 20 разведению антифосфосфовирусных антител CaMKII. Инкубируйте в темноте с легким покачиванием на ночь. На следующее утро, после трехкратного промывания эмбрионов 2%-ным NGS и PBTx, добавьте 1 из 5 разведение красного 568 флуоресцентного конъюгированного козьего анти-кроличьего IgG и 10% NGS и PBTx.

После инкубации в темноте при комнатной температуре в течение четырех часов промойте эмбрионы три раза и храните в PBTx или 50% глицерине в PBS в зависимости от процедуры визуализации. Чтобы поместить эмбрионы для визуализации, поместите от одного до пяти эмбрионов на предметное стекло. Используйте четыре уложенных фрагмента крышки номер один с каждой стороны от рыбы, чтобы создать камеру.

И положите сверху крышку. С помощью масляной иммерсионной линзы 100X и проходящего света сфокусируйтесь на одном эмбрионе. Выключите свет.

Включите конфокальный микроскоп с соответствующими лазерами и включите дистанционную фокусировку. Откройте конфокальную программу и на панели захвата выберите подходящий объектив. Затем на базовой панели XY нажмите на кнопку 1024, чтобы установить размер изображения.

На панели лазера и детектора нажмите на красные поля 488 и зеленые 568, чтобы включить лазерный детектор для каждого канала и установить отверстие в среднее положение. Затем в полосе усиления отрегулируйте усиление для каждого канала, чтобы визуализировать его. Затем на панели настроек получения нажмите кнопку «Трансляция», чтобы начать получение изображений.

На панели настроек вида снимите флажок «Принудительно установить интегральный зум» по центру в окне «Трансляция». На панели получения настроек на вкладке Z пошагово пройдитесь по слоям изображения. Выбрав количество слоев, которые нужно включить в изображение, переместитесь в некоторую точку в центре плоскости Z.

На вкладке Z щелкните маленькое красное справочное поле. Это приведет к обнулению RFA в точке, выбранной в качестве центра. В окошке с надписью размер шага выберите толщину слоев.

Обратите внимание на поле размера файла и постарайтесь ограничить количество файлов одним гигабайтом. Чтобы найти верхнюю крайнюю точку изображения, щёлкните по кругу рядом с верхним и пройдите по слоям Z. Теперь нажмите на круг внизу, и компьютер вернется к слою в качестве центра.

Затем в окне настроек сбора данных нажмите «Ввести в действие» еще раз, чтобы остановить лазерный захват. На этой панели нажмите на красные поля с надписями average и Z stack. Эти коробочки станут зелеными.

В окне получения настроек нажмите «Один», чтобы получить всю серию изображений. Отслеживайте ход сканирования по обоим каналам и по всему стеку Z. Чтобы сохранить, нажмите на окно тома, нажмите «Сохранить как» и присвойте файлу имя.

Чтобы выполнить объемный рендеринг файла, пока стек Z все еще открыт, выберите выпадающее меню данных и нажмите на объемный рендеринг. Сохраните визуализированный файл как файл dot tif. На этом рисунке показано иммуноокрашивание P-CaMKII и ацетилированного тубулина, который является стандартным маркером ресничек в везикуле Купфера или KV рыбки данио-рерио. Питающие первичные реснички генерируют круговой поток жидкости, что приводит к повышению уровня кальция в реснитчатых клетках, выстилающих KV, и активации CaMKII в дискретных местах, как показано здесь.

Эти рисунки показывают P-CaMKII в том виде, в каком он появляется на апикальной поверхности реснитчатых клеток, выстилающих определенные области промежностных протоков между 24 и 72 часами после оплодотворения или HPF. В течение одного дня развития эмбриональное ухо данио-рерио, зафиксированное PFA и метанолом, сохраняет свою структуру и позволяет обнаружить окрашивание CaMKII у основания и по всей длине киноцилума. При 72 HPF внутреннее ухо окрашивали фаллоидином Alexa 488 и антиацетилированным тубулином Alexa 568.

Фиксация метанола PFA сохраняет как F-актин, так и тубулин. Эта рыба из 30 HPF экспрессировала GFP, нацеленную на мембрану, которая терялась при фиксации метанола. Фиксация PFA приводила к уменьшению сигнала P-CaMKII по сравнению с фиксацией PFA и метанолом.

Однако на этой стадии развития сигнал достаточно сильный, чтобы его можно было обнаружить и без метанола. После освоения этой техники ее можно сделать за два дня, если она выполнена правильно. При попытке проведения этой процедуры важно помнить об использовании свежих эмбрионов и свежих свободных агентов.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как локализовать фосфопротеины в эмбрионах рыбок данио.