Корковая актин расхода в Т-клетках количественно пространственно-временной корреляционной спектроскопии Изображение структурированных данных микроскопии Освещение

Общая цель этого эксперимента заключается в количественной оценке динамики кортикального актина с помощью корреляционной спектроскопии изображения после получения с помощью полного внутреннего отражения, структурированной визуализации освещения или моделирования газона. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в биофизической области, например, какую роль играет кортикальный актиновый поток в регулировании взаимодействий в иммунологическом синапсе. Основное преимущество метода заключается в том, что он сочетает в себе нанометровое разрешение и совместимость с образом жизни, что позволяет наблюдать и анализировать процессы меньшего масштаба по сравнению с традиционными методами микроскопии.

Демонстрировать эту технику будет Джордж Эшдаун, аспирант из моей лаборатории. Для тестового образца добавьте пять микролитров субдифракционного флуоресцентного микросферного стокового раствора диаметром 100 нанометров на поверхность свежего покровного стекла без покрытия. Затем распределите микросферический раствор по крышке, нанесите на нее крышку с наконечником пипетки и дайте ей высохнуть.

Добавьте 200 микролитров монтажной среды в тестовую крышку, чтобы подготовиться к съемке, начать включать инкубатор для нагревателя сцены системы SIM газона и заполнить резервуар дистиллированной водой, чтобы полностью покрыть основание нагревательного элемента. Дайте воде уравновеситься до 37 градусов по Цельсию. Подсоедините нагревательный хомут к линзе объектива и установите его на 37 градусов Цельсия.

Затем закрепите совместимый градуировочный блок TURF 4 88 на световом пути микроскопа, чтобы убедиться, что используется правильный оптический путь. Переключите режим канала на лазерном станине в одно положение. Повторите это действие для оптоволоконного кабеля на предметном столике микроскопа.

Ожидайте появления ошибки в окне программного обеспечения, если эти действия не будут выполнены. Установив режим, опустите объектив в самую нижнюю плоскость Z и поместите на него каплю масла. Поместите крышку образца с флуоресцентными микросферами на предметный столик микроскопа.

Затем выберите идеальную систему фокусировки или функцию PFS на корпусе микроскопа. Постепенно перемещайте объектив вверх по плоскости Z и остановитесь, когда кнопка PFS перестанет мигать, что указывает на то, что в управляющем программном обеспечении достигнута фокальная плоскость. Переключитесь в режим live view, чтобы отобразить микросферы на экране.

Выполняйте точную регулировку фокусировки с помощью колеса микроманипулятора PFS. Наблюдайте равномерное освещение без расфокусированного флуоресцентного излучения выше 75-нанометровой волны запаха. Наконец, подтвердить, что структурированное освещение достигается путем наблюдения за флуктуирующим рисунком свечения от образца флуоресцентной микросферы, поскольку стимуляция Т-клеток справляется с камерами восьмерки.

Хорошо накройте слип 200 микролитрами смеси антител anti CD 3 и анти CD 28 и инкубируйте покровный слип в течение двух часов при 37 градусах Цельсия. После промывки покровного стекла, как описано в текстовом протоколе, поместите его на предметный столик микроскопа и найдите фокальную плоскость газона. Далее аккуратно пипеткой внесите 200 микролитров трансфицированных Т-клеток в одну из лунок на покровном листе.

Используйте эпифлуоресценцию для отслеживания трансфицированных актином клеток GFP, когда они приземляются на покровное стекло. Как только ячейки усядут, переключитесь в режим жизни с помощью N SimPad и убедитесь, что ячейки на мониторе находятся в фокусе. Чтобы записать временной ход, откройте окно сбора данных ND и выберите вкладку времени.

Затем нажмите «Добавить» и установите интервал без задержки. Установите продолжительность на 10 минут. Наконец, начните запись данных, выбрав «Запустить сейчас» в окне сбора данных ND.

Чтобы восстановить изображения, сначала откройте программное обеспечение для анализа, содержащее соответствующий модуль анализа. Нажмите на приложения и выберите окно «Показать конец симуляции». Установите модуляцию освещенности, контраст и шумоподавление с высоким разрешением равным единице и восстановите набор данных SIM-карты газона для создания полного изображения SIM-карты из строки состояния изображения.

Убедитесь, что размер пикселя составляет 30 нанометров, а затем экспортируйте данные в виде файлов TIF для анализа стиков. После скачивания и извлечения флешек программного комплекса MATLAB, откройте скрипт. Затем определите входные параметры, как указано в текстовом протоколе для фильтра удаления неподвижных объектов.

В строке 23 установите параметр фильтрации на скользящее среднее, а в строке 24 используйте 21 в качестве параметра скользящего среднего для создания одной векторной карты. Установите временную подобласть в строке 31 на максимальное количество кадров, в данном случае 63. Затем в строке 32 установите временной сдвиг равным единице в строках с 33 по 35.

Введите имена выходных файлов, заголовки выходных векторных карт и путь к выходному каталогу. Затем определите формат, в котором должны быть сохранены изображения векторной карты. В этом случае png.

В окне редактора MATLAB откройте скрипт. Запустите один канал и загрузите ряд изображений, выполнив строки с первой по 23-ю строки сценария. Далее прогоните строки с 29 по 35 одного канала.

Чтобы начать анализ палочек, следуйте инструкциям и выберите многоугольник, чтобы определить область интереса или ROI, если это необходимо. Чтобы отобразить векторные карты, проведите строки с 38 по 52. Затем проведите строки с 53 по 72 для построения гистограммы величины скорости, показанной здесь, это OT T-клетка, экспрессирующая GFP, меченная F-актином, которая была получена с помощью протокола turf sim.

Обсуждается в тексте через пять минут после того, как эта клетка была помещена на покровное покрытие, покрытое антителами против CD 3 и против CD 28, предназначенными для стимуляции образования иммунологических синапсов. Для этого был взят временной цикл, чтобы можно было визуализировать молекулярный поток factin. Последующий анализ этих данных с помощью этой программы палочки позволил количественно оценить молекулярный поток F-актина, как показано на этой векторной карте, соответствующей квадратной области клетки слева, которая представляет собой часть периферии синапса.

Дальнейшее увеличение этой карты и субобласти Т-клеток проясняет направленность и скорость потока актина, которые могут быть определены по длине вектора, а данные о скорости цветового кода также могут быть отображены в гистограмме, что позволяет проводить статистический анализ. В совокупности эти результаты показывают, что в иммунологическом синапсе F-актин симметрично течет от периферии к клеточному центру. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как получать ts в данных и анализировать динамику актина коры головного мозга с помощью корреляционной спектроскопии изображений.

Хотя этот метод может быть использован для получения представления о потоке актина во время миграции Т-клеток, он также может быть использован в других системах, где молекулярный поток считается важным, например, при миграции клеток.