Транскриптом профилирование In-Vivo Производимые Бычьи Эмбрионы предимплантационной Использование Двухцветный Microarray платформы

Общая цель этого видео состоит в том, чтобы обеспечить оптимизированную техническую процедуру с использованием двухцветного изготовленного на заказ массива крупного рогатого скота с использованием низкого количества общей РНК из эмбрионов крупного рогатого скота седьмого дня. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, касающиеся потери эмбриона у высокопродуктивных молочных коров, а также на вопросы о качестве эмбриона относительно экспрессии генов в развивающемся эмбрионе до имплантации. Преимущество этого метода заключается в том, что мы можем изучать экспрессию генов с помощью пикограммы уровня общей РНК, выделенной из отдельных эмбрионов.

Этот метод может дать представление о факторе, влияющем на выживаемость бычьих эмбрионов, произведенных in vivo до имплантации. Это также может помочь улучшить репродуктивные технологии, такие как производство эмбрионов in vitro. Чтобы начать процедуру, подготовьте замороженные эмбрионы крупного рогатого скота в микроцентрифужной пробирке из набора для экстракции РНК пикомасштаба на основе колонны.

Добавьте в пробирку 10 микролитров буфера для лизиса и инкубируйте эмбрионы при температуре 42 градуса Цельсия в течение 30 минут. Затем центрифугируйте пробирку в течение двух минут при 800-кратном G.Пипетке внесите 250 микролитров кондиционирующего буфера в фильтрующую мембрану очистительной колонны и инкубируйте колонку в течение пяти минут при комнатной температуре. Центрифугируйте сборную пробирку при 16 000 умноженных на G в течение одной минуты, чтобы завершить предварительную подготовку колонны.

Добавьте 10 микролитров 70%-ного этанола в смесь лизисного буфера и эмбрионов и хорошо перемешайте. Затем загрузите смесь в очистную колонну. Центрифугируйте колонку в течение двух минут при 100 перегрузках, а затем при 16 000 перегрузках в течение 30 секунд.

Добавьте в колонку 100 микролитров первого промывочного буфера и центрифугируйте при 8 000 G в течение одной минуты. С помощью набора ДНКазы смешайте пять микролитров исходного раствора с 35 микролитрами буфера и перемешайте, аккуратно перевернув закрытую пробирку. Затем загрузите смесь DNase на мембрану очистительной колонны и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре.

Добавьте в колонку 40 микролитров первого промывочного буфера и центрифугируйте при 8 000 G в течение 15 секунд. Затем добавьте 100 микролитров второго буфера для промывки, и центрифугируйте в течение минуты. Добавьте еще одну порцию второго промывочного буфера в колонку и центрифугируйте в течение двух минут при 16 000 раз G. Перенесите очистительную колонку в другую микроцентрифужную пробирку и загрузите 11 микролитров элюирующего буфера на мембрану колонки.

Выдержите колонку в течение одной минуты при комнатной температуре. Центрифугируйте колонку в течение одной минуты при 1000 умноженных на Гс, а затем еще на одну минуту при 16000 Г. Проверьте качество и количество элюированной РНК, а затем храните образец при отрицательной температуре 80 градусов Цельсия. С помощью набора для амплификации амплифицируйте 100 пикограмм высококачественной РНК.

Оцените диапазон размеров амплифицированной аРНК с помощью количественного определения на основе флуоресценции. Затем определите концентрацию аРНК с помощью спектрофотометрии. Приготовьте два микрограмма амплифицированной аРНК для флуоресцентного мечения с помощью стандартного набора.

Установите озоновую камеру в темной комнате и подождите, пока уровень озона снизится до 0,001 частей на миллион. Поместите фильтр темной комнаты на свет. Затем поместите образец в озоновую коробку и добавьте по два микролитра цианина, пяти красителей и буфер для маркировки.

Поместив образец под безопасным светом, добавьте воду, не содержащую РНКазы, чтобы достичь общего объема 20 микролитров. Аккуратно перемешайте образец, а затем инкубируйте пробирку в термоамплификаторе при температуре 85 градусов Цельсия в течение 15 минут. Охладите образец на льду в течение одной минуты, а затем раскрутите образец вниз.

Очистите помеченную и амплифицированную аРНК с помощью набора для экстракции РНК. С помощью соответствующего типа спектрометра определяют концентрацию меченой, амплифицированной аРНК. Приготовьте второй образец амплифицированной аРНК, меченный цианином и тремя красителями.

Храните образцы аРНК при отрицательных 80 градусах Цельсия в течение трех дней. Соедините по 825 нанограммов Cy3 и 5-меченой аРНК. Добавьте к этому буфер блокировки и буфер фрагментации.

Выдерживайте смесь при температуре 60 градусов Цельсия в течение 15 минут, а затем охлаждайте на льду в течение одной минуты. Добавьте 55 микролитров буфера для гибридизации, и хорошо перемешайте, не внося пузырьков воздуха. Центрифугируйте смесь при 11, 300 раз G в течение одной минуты.

Загрузите 100 микролитров образца на предметное стекло матрицы и запечатайте предметное стекло в камере гибридизации. Гибридизуйте образец в течение 17 часов при температуре 65 градусов Цельсия, вращаясь со скоростью 10 оборотов в минуту. Приготовьте озоноразрушающий, стабилизирующий и осушающий раствор.

Промойте массивы, приняв меры предосторожности, чтобы свести к минимуму воздействие озона, а затем погрузите их в стабилизирующий и осушающий раствор на 30 секунд. Убедитесь, что поверхность массива сухая и на ней нет пыли. Храните массивы в темном месте.

Включите сканер микрочипов и подождите, пока он будет готов к сканированию. Затем загрузите массив со штрих-кодом слева. Выполните точечный анализ и сохраните данные в виде файла георадара.

В программном обеспечении для статистического анализа нормализуйте и анализируйте данные. Рассчитайте положительный порог выбора пятна и просмотрите график гибридных и фоновых сигналов. Выполните нормализацию по лёссу внутри массива, а затем нормализацию по квантилю между массивами.

Экспортируйте нормализованные данные в файл электронной таблицы. Используйте все положительные сигналы в репозитории данных микрочипа для создания списка идентификаторов выбранных уникальных генов. Загрузите список идентификаторов в базу данных классификации и анализа белков, выбрав bos taurus в качестве организма, и выполните тест на статистическую избыточную представленность по умолчанию.

После двухраундового усиления фрагменты очень похожи по размеру и хорошего качества. Успешная амплификация этим методом должна дать как минимум тысячекратное увеличение аРНК. Высококачественное изображение с микрочипа имеет высокую интенсивность пятна и низкую интенсивность фона на обоих каналах.

Если интенсивность фона слишком высокая, разрешение сигнала будет плохим. Около 46% пятен находились над фоном, из которых было выделено 6 765 уникальных транскриптов РНК, экспрессированных в бластоцисте. Тест на статистическую избыточную представленность показал, что 10 основных терминов онтологии генов представляют собой активные процессы клеточного деления.

Разработка этого метода позволила исследователям в области репродукции животных изучить экспрессию генов эмбриона и оценить, как различные факторы влияют на развивающийся эмбрион. Этот метод также был разработан для других важных видов, таких как свиньи. После этой процедуры для проверки результатов микрочипов можно использовать другие методы, такие как количественная ПЦР.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как извлекать РНК из эмбрионов, а также как амплифицировать и маркировать РНК для выполнения двухцветного анализа микрочипов.