Получение Крыса олигодендроцитов предшественники культур и Количественная оценка Oligodendrogenesis Использование двойного инфракрасного флуоресцентного Сканирование

Общая цель этой процедуры заключается в выделении и культивировании клеток-предшественников олигодендроцитов крысы и количественной оценке олигодендрогенеза в ответ на экспериментальные факторы. Эффективный олигодендрогенез является терапевтической целью во многих областях исследований, включая травмы спинного мозга, неонатальную гипоксию и демиелинизирующие заболевания, такие как поперечный миелит и рассеянный склероз. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он сочетает в себе протокол выделения большого количества OPC с быстрым и надежным методом определения олигодендрогенеза в нескольких экспериментальных условиях одновременно.

Чтобы начать эту процедуру, простерилизуйте все оборудование для препарирования с помощью стерилизатора с подогревом шариков. Затем добавьте от 15 до 20 миллилитров PBS в 50-миллилитровую коническую трубку. Поместите коническую трубку на лед и используйте ее для удержания нарезанной кубиками коры ткани во время рассечения.

Далее добавьте холодный PBS в 10-сантиметровую чашку Петри, которая будет использоваться для вскрытия под световым микроскопом. Принеся в жертву крысиных детенышей, разрежьте кожу за ушами по средней линии с помощью маленьких ножниц. И отслаиваем кожу лоскутами назад.

Далее разрежьте черепную коробку по средней линии от ствола мозга к глазам. И будьте осторожны, чтобы не резать слишком глубоко, чтобы сохранить структуру нижележащей коры. После этого сделайте два боковых разреза ниже мозжечка, вставив в большое затылочное отверстие небольшие хирургические ножницы.

Сделайте дополнительный надрез между глазами перед обонятельными луковицами. Тщательно очистите каждую половинку черепной коробки назад. Удалите весь мозг и поместите его в 10-сантиметровую чашку Петри, наполненную холодной PBS.

Под рассекающим световым микроскопом удалите обонятельные луковицы и мозжечок с помощью тонких хирургических щипцов. Переверните мозг так, чтобы была видна вентральная поверхность. Затем с помощью тонких прямых щипцов выполните тупое рассечение, поместив закрытые кончики щипцов между корой и гипоталамусом на глубину около двух третей мозга.

Откройте щипцы, как только они будут на месте, затем повторите процедуру для другого полушария. После этого дразните кору головного мозга из гипоталамуса и среднего мозга. Удалите гипоталамус, таламус и средний мозг, удерживая средний мозг у его задней поверхности и отслаивая его по направлению к переднему концу мозга.

Впоследствии разорвите передние соединения. С помощью тонко изогнутых щипцов для рассечения удалите гиппокамп и разорвите его связь с корой головного мозга. Затем удалите оставшийся стриатум, соскоблив его с нижележащей коры диагональным движением наружу.

Очистите кровеносные сосуды и мозговые оболочки от вентральной поверхности коры головного мозга. Далее переверните мозг так, чтобы была видна дорсальная поверхность. Отделите мозговые оболочки от нижележащей коры, где находится обонятельная луковица.

Повторите процедуры в общей сложности для трех-четырех крысят. И поместите всю рассеченную кору в чашку Петри. Измельчите их стерилизованным лезвием бритвы до тех пор, пока не получатся кусочки размером один миллиметр на один миллиметр.

Затем соберите салфетки, ополоснув тарелку PBS, прежде чем положить ее обратно на лед. Теперь с помощью стеклянной пастеровской пипетки, прикрепленной к контроллеру пипетки, механически диссоциируйте ткань путем пипетирования десять-пятнадцать раз или до тех пор, пока кусочки ткани не уменьшатся в размерах и раствор не помутнеет. Далее верните образец в инкубатор для культуры тканей при температуре 37 градусов Цельсия на 15 минут при непрерывном вращении.

После этого добавьте 10 миллилитров PBS в каждый образец и отфильтруйте гомогенат через фильтр пор размером 40 микрометров, помещенный над 50-миллилитровой пробиркой. Затем промойте фильтр еще одним-двумя миллилитрами PBS. Объедините все гомогенатные образцы в одну коническую пробирку объемом 50 миллилитров и получите общее количество клеток.

После подсчета клеток равномерно разделите гомогенат на конические пробирки по 15 миллилитров и центрифугируйте их в течение 10–12 минут при 300 г. Подготовьте каждый столбец LS, добавив пять миллилитров буфера столбца. И собирать поток через 15 миллилитровую коническую трубку.

После того, как буфер колонки полностью пройдет через верхнюю камеру, нанесите 1000 микролитров клеточной суспензии на каждую колонку и позвольте клеткам пройти через нее под действием силы тяжести. Далее снимите каждый столбик и поместите его в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Добавьте пять миллилитров буфера столбца и быстро проведите буфер через столбец, чтобы вытеснить связанные ячейки и освободить их от столбца.

Чтобы покрыть клетки, разбавьте их пролиферирующей средой OPC до 60 000 клеток на миллилитр. Пипеткой внесите 500 микролитров клеток вдоль боковой стороны каждого черного, прозрачного дна лунки на 24 лунки. Перемешайте ячейки, встряхивая пластину горизонтально, с помощью движения в виде восьмерки.

Во время этой процедуры поместите наконечник пипетки объемом 200 микролитров на стеклянную пипетку Пастера, чтобы убедиться, что лунка не будет повреждена во время аспирации. Затем отсасывайте среду из культуральных лунок по одной группе обработки за раз, чтобы избежать пересыхания клеток. После этого медленно добавьте 500 микролитров лечебной мастер-смеси вдоль стенки лунки с помощью одномиллилитровой пипетки.

Инкубируйте культуры и проводите полный обмен сред со свежими средами для обработки каждые два-три дня. По окончании желаемого периода лечения сделайте аспирацию из среды. Медленно добавьте 400 микролитров PFA на бортик лунки, чтобы зафиксировать клетки.

И выдержать тарелку 20 минут при комнатной температуре. Через 20 минут аспирируйте PFA и медленно добавьте 500 микролитров стерильного D-PBS для промывания клеток. Повторите промывку еще два раза и не отсасывайте окончательную промывку.

Теперь доведите пластину до комнатной температуры, аспирируйте лунки и добавьте 250 микролитров D-PBS, содержащего пять процентов NGS и 0,1 процента Triton x-100. Инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение одного часа с легким встряхиванием орбиты. Приготовьте первичный инкубационный раствор путем разведения мышиного моноклонального антитела против ПМБ и кроличьего поликлонального антитела против олиг2 в D-PBS, содержащем пять процентов NGS.

Затем инкубируйте первичные антитела при четырех градусах Цельсия в течение ночи в течение 16-18 часов с легким встряхиванием орбиты. Во время мытья планшета приготовьте вторичный инкубационный раствор, разбавив антитела против мыши 680 и антитела против кролика 800 в D-PBS, содержащем пять процентов NGS. Далее отсасывайте окончательную промывку и добавляйте 250 микролитров вторичного инкубационного раствора.

Защитите пластину от света и выдержите ее при комнатной температуре в течение одного часа, слегка встряхивая орбиту. После этого отсканируйте пластину с помощью системы визуализации, способной обнаруживать флуоресцентное излучение 700 нанометров и 800 нанометров. В качестве отправной точки установите смещение фокуса на три и чувствительность на одну целую пять десятых для MBP, пять целых ноль целых для актина и три целых пять целых для olig2.

При необходимости отрегулируйте значения чувствительности, чтобы избежать передержки сигнала. На этой схеме анализ DIFS начинается со свежевыделенных A2B5-положительных OPC крыс, нанесенных на культуральные сосуды с кодировкой PLL. Эти культуры размножают в течение трех дней в присутствии 20 нанограммов на миллилитр PDGFAA, а затем обрабатывают экспериментальными факторами в свежих средах, не содержащих PDGF, в нулевой день.

Лечебные среды полностью восполняются на второй день. И клетки фиксируются 4 процентами параформальдегида на четвертый день. Здесь иммуноцитохимия для olig2 и MBP была проведена на репрезентативных культурах на нулевой и четвертый день с использованием Dapi в качестве ядерного контркрасителя.

Эти культуры демонстрируют конститутивное окрашивание для маркера клеток линии панолигодендроцитов, Olig2, в нулевой и четвертый дни. В то время как окрашивание на зрелый маркер олигодендроцитов МБП было заметно только к четвертому дню. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как очищать, культивировать и дифференцировать A2B5-положительные OPC крыс, чтобы количественно оценить влияние экспериментальных факторов на олигодендрогенез.

Выявление факторов, способствующих олигоденрогенезу, имеет особое значение для изучения демиелинизирующих заболеваний, таких как рассеянный склероз. После освоения описанные здесь методы могут помочь выявить такие факторы и, в конечном итоге, разработать более эффективные методы лечения.