Усовершенствованный метод Rapid интубации трахеи у мышей

Общая цель этой процедуры заключается в обеспечении быстрого, простого и надежного введения реагентов в легкие мыши путем интубации. Метод также ограничивает риск остаточного повреждения окружающих тканей и является недорогим. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области фундаментальной биологии легких и механизмов заболеваний.

Например, острое повреждение легких и фиброгенез. Основные преимущества этой методики заключаются в том, что она обладает высокой воспроизводимостью, проста в освоении, не требует специализированного оборудования или длительного времени восстановления. Процедуру необходимо выполнять с использованием стерилизованных инструментов.

Поэтому автоклавируйте как тупой конец щипцов, так и депрессор. В стерилизованном колпаке подготовьте рабочий запас реагента для введения через интубацию. Рекомендуется объем болюса от 30 до 45 микролитров.

Обрабатывайте раствор ультразвуком в течение 10 минут с частотой 35 килогерц, чтобы обеспечить равномерное перемешивание. Теперь подготовьте рабочее пространство. Выделите не менее квадратного метра пространства для самого рабочего пространства.

А также отдельные места для животных как до, так и после процедуры. Теперь подготовьте процедурную доску. Эта индивидуальная модель вырезана из алюминиевого листа и усилена Т-образным кронштейном.

Подобные коммерческие платы также выпускаются. С помощью нескольких полосок скотча закрепите основание процедурной доски к скамейке, таким образом, она будет находиться прямо перед экспериментатором. Затем завяжите шов длиной 4,0 между двумя позиционирующими винтами процедурной доски.

Далее соберите спирометр. Извлеките поршни из трех одномиллилитровых шприцев. Затем загрузите до 60 микролитров PBS в верхнюю часть каждого цилиндра шприца.

Неплотно закрепите один из этих трех шприцев на ступице катетера. При использовании воздух, выходящий из трахеи, заставляет PBS в бочке подниматься и опускаться. Поместите его рядом с процедурной доской.

Поместите два других шприца в пределах досягаемости, чтобы они служили резервными. Далее, в четвертый шприц, наберите 300 микролитров воздуха, и поместите его с одной стороны доски. Также подготовьте несколько шестидюймовых отрезков ленты, чтобы прикрепить животное к доске.

Затем при необходимости установите камеру с изофлураном. Подсоедините линии кислорода, изофлурана и вакуума к соответствующим портам на камере и вакуумному разряду. Начните с обезболивания мыши.

Важно отметить, что такие факторы, как возраст, вес и состояние здоровья животного, могут изменить реакцию на анестетики, каждая лаборатория должна оптимизировать воздействие изофлурана для удовлетворения своих собственных потребностей. Во время ожидания загрузите болюс реагента в наконечник для пипетки и отложите его в сторону. Когда мышь будет успокоена, подвесьте ее за верхние резцы к нити на платформе для процедуры, при этом спинка животного должна лежать плашмя на поверхности платформы.

Теперь, стараясь не ограничивать вентиляцию, свободно прикрепите нижнюю часть грудной полости, чуть выше диафрагмы, к платформе, чтобы животное было выровнено во время процедуры. Затем установите осветитель гусиной шеи на 80-100% Расположите свет на расстоянии одного-двух сантиметров от поверхности кожи рядом с солнечным сплетением и регулярно проверяйте, не перегревает ли он кожу. Сзади платформы используйте тупые щипцы для определения местоположения языка.

Затем, стараясь не затрагивать нижние резцы, аккуратно возьмитесь за язык и вытяните его из ротовой полости. Фиксируя язык, расплющите его депрессором в недоминирующей руке, позволяя щипцам освободиться. Теперь проведите гусиную шею примерно от солнечного сплетения к основным стволовым бронхам, чтобы осветить трахею.

Трахею также можно легко отличить по действию дыхания, которое заставит свет колебаться в интенсивности, когда он покидает трахею. При правильном расположении трахея может рассматриваться как центральный источник света, при этом окружающий свет в самой полости рта минимален. Катетер не должен входить в ротовую полость до тех пор, пока вид трахеи не будет идеальным.

Трахея не может быть видна ни с помощью источника света, ни с помощью депрессора. Исследователи должны освободить язык и повторить процедуру. Далее наклоните шприц так, чтобы он следовал естественному пути трахеи.

И опустите наконечник катетера 22 калибра с прикрепленным шприцем, содержащим PBS, прямо в просвет. Теперь введите в катетер еще пять миллиметров и снимите депрессор языка. При правильном размещении пузырь PBS в бочке начнет подниматься и опускаться с каждым вдохом.

Будьте терпеливы при поиске этого индикатора, так как как как сильная и легкая седация может изменить частоту дыхания. Затем переложите шприц на недоминирующую руку. Взявшись за концентратор, аккуратно извлеките шприц, оставив катетер на месте.

Из доминирующей руки внесите подготовленный комок реагента непосредственно в центр концентратора катетера. Затем присоедините второй шприц с 300 микролитрами воздуха и выдавите воздух в ступицу. Это поможет обеспечить хорошее распределение комола в легких.

Теперь извлеките шприц и замените его шприцем, содержащим пузырь PBS. Пузырь будет продолжать подниматься и опускаться, если процедура была выполнена успешно. Теперь снимите катетер и пластырь.

И поместите животное в сухое теплое место до тех пор, пока оно не придет в сознание. Как правило, в течение пары минут. Интубированные мыши ежедневно контролировались на предмет потери веса.

Мышей собирали через 4, 10 и 17 дней после интратрахеальной интубации блеомицином. Из этих легких был собран бронхоальвеолярный лаваж и проанализирован. Повышенные уровни IgM продемонстрировали значительное зависящее от времени увеличение проницаемости легких, что свидетельствует о дисфункции эпителиального и/или эндотелиального барьера.

Правые легкие были зафиксированы и окрашены трихромом Массона. Была количественно определена фиброгенная реакция, хорошо установленный маркер общего содержания коллагена. Гистологические срезы показали зависимое от лечения утолщение легочного интерстиция и увеличение фиброзных поражений.

Как только вы освоите эту технику, ее можно выполнить менее чем за минуту, если ее правильно выполнить. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что манипуляции с мягкими тканями, окружающими трахею, не являются необходимыми или рекомендуемыми. И это может поставить под угрозу как здоровье животного, так и честность эксперимента.