Анализ В Vivo Миграция клеток с использованием мобильных трансплантаций и время покадровой визуализации у эмбрионов данио рерио

Общая цель этой процедуры заключается в анализе функции гена-кандидата в контроле миграции клеток in vivo с помощью трансплантации клеток в сочетании с визуализацией в реальном времени в эмбрионе рыбки данио. Этот метод может помочь решить ключевые вопросы в области миграции клеток, такие как определение роли и важности новых генов-кандидатов в миграции клеток in vivo. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она создает мозаичные эмбрионы, что обеспечивает хорошую визуализацию и клеточный аденомиоз.

Для подготовки игл для трансплантации клеток используйте микропипетку, чтобы потянуть за стеклянный капилляр. Затем с помощью микрокузницы разрежьте кончик иглы в точке, где внутренний диаметр составляет 35 микрометров. С помощью микрошлифовальной машины срежьте конец капилляра под углом 45 градусов.

Чтобы удалить остатки стекла, вставьте иглу в иглодержатель, установленный на шприце, затем используйте 2%-ную фтористоводородную кислоту для трехкратного промывания внутренней части иглы, втягивая раствор внутрь и наружу. Затем промойте иглу ацетоном три раза. Для приготовления посуды для инъекций или трансплантации клеток готовят 1%-ную агарозу, нагревая в микроволновой печи 50 миллилитров эмбриональной среды, содержащей 0,5 грамма агарозы, в течение одной минуты на полной мощности.

Охладите агарозный гель примерно до 60 градусов Цельсия и вылейте весь объем в 90-миллиметровую чашку Петри. Вставьте форму, чтобы создать линии для инъекции или для создания лунок для трансплантации клеток. Когда агарозный гель застынет, используйте щипцы для удаления формы.

Для введения донорских эмбрионов под стереомикроскопом с помощью щипцов собранные трансгенные эмбрионы аккуратно выдавливаются в линии инъекционной чашки, заполненной эмбриональной средой. С помощью щипцов расположите эмбрионы клетками вверх, затем инкубируйте чашку при температуре 28 градусов Цельсия, пока эмбрионы не достигнут четырехклеточной стадии. Далее загрузите в иглу для инъекций два микролитра ранее приготовленного инъекционного раствора, содержащего актин-связывающий домен дрожжевого актинсвязывающего белка 140, связанного с mcherry.

Затем вставьте иглу в иглодержатель, прикрепленный к микроманипулятору и подключенный к воздушному трансжектору. Откройте иглу, используя тонкие щипцы, чтобы осторожно коснуться кончика иглы или зажав ее конец. Затем введите иглу в одну из четырех клеток и введите раствор, чтобы заполнить 70% объема клетки.

Аналогичным образом ввести 30 эмбрионов. Когда эмбрионы достигнут стадии сферы, с помощью пластиковой пастбищной пипетки переносят эмбрионы трансгенного гусекоида GFP хозяина и ранее введенные донорские эмбрионы в отдельные 35-миллиметровые чашки Петри, покрытые одномиллиметровой агарозой в эмбриональной среде и заполненные эмбриональной средой Pen/Strep. С помощью тонкого пинцета вручную извлеките зародыши из их хорионов.

Затем поместите эмбрионы в инкубатор при температуре 28 градусов по Цельсию. Когда эмбрионы достигли стадии щита под флуоресцентным микроскопом, отбирают донорские эмбрионы, экспрессирующие ABP140 mcherry в зеленом щитке. С помощью отполированной огнем пастбищной пипетки перенесите эмбрионы хозяина в ряд лунок в чашке для трансплантации клеток, заполненной Pen/Strep EM. Затем поместите донорские эмбрионы в соседний ряд.

Далее с помощью ресницы аккуратно ориентируйте зародыши щитком вверх. Затем с помощью иглодержателя, прикрепленного к шприцу, промойте кончик иглы, втягивая и выталкивая 70% этанола. Высушите иглу, втягивая в нее воздух.

Когда игла высохнет, вставьте ее в иглодержатель, соединенный со шприцем Hamilton, скосом вверх. Чтобы провести трансплантацию от щита к щиту, введите иглу для трансплантации в щит донорского эмбриона и наберите от 10 до 20 клеток, меченных ABP140 mcherry. Тщательно избегайте вытягивания желтка.

Пересадите клетки в щит эмбриона-хозяина и повторяйте перенос клеток до тех пор, пока не будут пересажены все эмбрионы хозяина. Когда трансплантация будет завершена, используйте отполированную до блеска пастбищную пипетку, чтобы удалить поврежденные эмбрионы. Инкубируйте пересаженные эмбрионы при температуре 28 градусов Цельсия в течение примерно 30 минут, чтобы дать им восстановиться.

Для трансплантации одиночных клеток-предшественников прехордальной пластины после дехорионизации эмбрионов, как было продемонстрировано ранее, используйте отполированную огнем пастбищную пипетку для переноса трех донорских эмбрионов в чашку для трансплантации клеток, заполненную кольцевыми кольцами без кальция Pen/Strep. С помощью тонкого пинцета для каждого эмбриона препарируют эксплант, содержащий введенные ABP140 mcherry меченые клетки и быстро отбраковывают остальные эмбрионы. С помощью ресниц аккуратно размешайте экспланты до тех пор, пока клетки не диссоциируют.

Затем поместите одну изолированную клетку в трансплантационную иглу и пересадите ее в щит эмбриона-хозяина, как было показано ранее в видео. Для оптимального контроля аспирации и трансплантации поддерживайте разделение воздуха и воды на расстоянии около 20 сантиметров от конца иглы. Для установки эмбрионов наполните стеклянный нижний флакон одним миллиметром горячей 0,2%-ной агарозы в ЭМ. Поместите флакон при температуре 42 градуса Цельсия в термоблок.

Перенесите выбранный эмбрион в раствор агарозы и выбросьте излишки среды для эмбрионов из пипетки. Затем втяните зародыш в пипетку с агарозой и перенесите его в заранее подготовленную камеру визуализации вместе с каплей агарозы. Перед тем, как агароза будет закреплена, используйте ресницу, чтобы сориентировать эмбрион, поместив перспективную прехордальную пластину вверх для визуализации с помощью вертикального микроскопа или на стеклянное дно для визуализации с помощью перевернутого микроскопа.

На ориентацию эмбриона перед застыванием агарозного геля потребуется около 40 секунд, в зависимости от температуры в помещении. Быстро сориентируйте эмбрион, манипулируя бластодермой, а не желтком, который очень хрупкий. После того, как все эмбрионы установлены и агароза установлена, используйте Pen/Strep EM для заполнения камеры, чтобы предотвратить высыхание эмбрионов.

Проводите визуализацию живых клеток и исследования клеточной динамики в соответствии с текстовым протоколом. Метод, продемонстрированный в этом видео, был использован для анализа роли Sin1, одного из основных компонентов второго комплекса TOR в контроле миграции клеток in vivo. В этом фильме показана миграция трансплантированных клеток-предшественников прехордальных пластин

Мечение актином позволяет визуализировать богатые актином цитоплазматические выступы. Путем анализа частоты и ориентации было замечено, что клетки дикого типа часто образуют большие цитоплазматические выступы, ориентированные в направлении животного полюса и миграции. Как видно на этом рисунке, потеря функции Sin1 приводит к резкому сокращению числа выступов и рандомизации оставшихся выступов, демонстрируя важность Sin1 в контроле образования богатых актином выступов.

Интересно, что фенотип Sin1 может быть спасен экспрессией конститутивно активной формы Rac1, что убедительно свидетельствует о том, что TOR C2 контролирует динамику актина и образование клеточного выпячивания через Rac1. Этот метод также был использован для анализа роли арпина, ингибитора комплекса ARP2/3 в миграции клеток. Как показано на рисунке, потеря функции арпина приводит к увеличению частоты выступов, что обусловлено либо более частым формированием выступов, либо повышением стабильности выступа.

При измерении времени жизни выступов в отсутствие арпина было выявлено, что временная персистенция выступов увеличилась в два раза, что свидетельствует об увеличении стабильности. После освоения трансплантация около 30 эмбрионов может быть выполнена за 45 минут. При попытке выполнить эту процедуру важно следить за развитием эмбрионов, так как все этапы критически рассчитаны по времени.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как живая конфокальная микроскопия, чтобы обеспечить лучшую визуализацию и ответить на вопросы, касающиеся субклеточной организации цитоскопических элементов, маркеров полярности, белков добавления или любого другого клеточного компонента. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать трансплантаты предшественников прехордальных пластин для анализа роли любого гена-кандидата в миграции клеток in vivo.