Миелоидный Выделение клеток из кожи мышей и Слив лимфатического узла После внутрикожной иммунизации с живой аттенуированной Plasmodium Спорозоиты

Общей целью этого комплекса процедур является иммунизация мышей паразитами плазмодия, ослабленными радиацией. Для облегчения анализа рекрутирования миелоидных клеток в коже мышей и дренирующих лимфатических узлах. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области малярии, например, какие клеточные субъекты участвуют во врожденном иммунном ответе на живых ослабленных паразитов.

В период между 18-25 днями после заражения кровь, прием пищи, сбор и холодная обезболивание инфицированных комаров в 15-миллилитровую пробирку со льдом. Затем осторожно переверните трубку в чашку Петри на льду и подвергните насекомых гамма-облучению или рентгеновскому облучению в 12 килорад. Соберите облученные слюнные железы комара в 15 мкл DPBS на лед.

А затем аккуратно раздавите железы, чтобы освободить спорозоиты. Введение высококонцентрированной суспензии паразита в небольшом объеме имеет решающее значение, поэтому важно собрать достаточное количество слюнных желез у хорошо зараженных комаров, о чем свидетельствует сильная экспрессия зеленой флуоресценции. Перед фильтрацией суспензию паразитов повторно суспендировать через 35-микрометровое ситечко, адаптированное к микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитров.

С помощью микроскопа счетной камеры подсчитывают общее количество выделенных спорозоитов и корректируют суспензию паразита до 8,3 умножить на десять до четвертой концентрации спорозоитов на микролитр в холодном DPBS на льду. Перед введением спорозоитов подтвердите надлежащий уровень седации подопытного животного путем ущипывания пальцев ног и нанесите глазную мазь для предотвращения высыхания роговицы. Затем, работая быстро, с помощью прозрачного скотча аккуратно зафиксировать вентральную сторону ушной раковины под стереомикроскопом и загрузить десятилитровый шприц, оснащенный иглой 35 калибра, 0,6 микролитра ресуспендированных паразитов.

Далее осторожно введите иглу скошенной стороной вверх под эпидермис на тыльной стороне уха и введите в участок 0,15 микролитра спорозоитов. В месте инъекции будет наблюдаться характерная папула. После введения дермы еще три раза, как только что продемонстрировано, осторожно снимите ленту и наблюдайте за мышью до полного ее восстановления.

В желаемый момент времени после инокуляции спорозоита принесите мышь в жертву и немедленно начните процедуру. Убедитесь, что у мыши демонстрируются признаки клинической смерти. Продезинфицируйте ухо и соответствующую область шеи 70-процентным этанолом.

Далее с помощью стерильных ножниц и щипцов сделайте разрез в жугуло-сонной области. Затем растяните разрез двумя щипцами, чтобы обнажить серый дренирующий лимфатический узел. Осторожно зажмите и удалите соединительную ткань непосредственно над лимфатическим узлом и извлеките ее с помощью второй пары щипцов, помещенных под ней.

Переложите лимфатический узел в ситечко размером 70 мкм в одну лунку шестилуночного тканевого культурального планшета, содержащего 4,5 миллилитров стандартной среды, дополненной коллагеназой и ДНКазой. Затем соберите все привитое ухо и с помощью двух щипцов защипните и разделите ухо на тыльную и вентральную стороны. Затем поместите каждую сторону уха в лунку второй шестилуночной пластины, содержащей 4,5 миллилитров на лунку среды, дополненной пищеварительными ферментами, следя за тем, чтобы каждая ткань была полностью погружена в среду.

Чтобы изолировать иммунные клетки от лимфатических узлов, инкубируйте пластину лимфоидной ткани при температуре 37 градусов Цельсия и пяти процентах CO2 при легком перемешивании. Через 15 минут добавьте десять миллимоляров ЭДТА в каждую лунку и положите пластину на лед. Далее для каждого лимфатического узла используйте конец нового пятимиллиметрового поршня шприца и прижмите лимфатический узел к ситечку круговыми движениями для диссоциации ткани.

Когда останется только белая соединительная ткань, дважды промойте ситечко 500 микролитрами DPBS, содержащими FBS и EDTA, и переложите средство для промывания в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Затем промойте лунку еще два раза 500 микролитрами дополненного DPBS и переложите промывку в трубку, помещенную на лед. Чтобы изолировать иммунные клетки от уха, инкубируйте листочки уха при температуре 37 градусов Цельсия и пяти процентах CO2 при легком перемешивании.

Через 20 минут разрежьте ткани на более мелкие кусочки, чтобы облегчить их переваривание, и верните образцы в инкубатор. Через 40 минут остановите пищеварение с помощью десяти миллимоляров ЭДТА и положите тарелку на лед. С помощью пипетки объемом в один миллилитр с отрезанным наконечником перенесите все содержимое каждой лунки в новые лунки, содержащие сетчатые фильтры размером 70 микрон.

И используйте пятимиллилитровый поршень шприца, чтобы диссоциировать фрагменты ушной ткани круговыми движениями, как только что продемонстрировано. Когда останутся только белая соединительная ткань и волосы, промойте ситечки и лунки DPBS плюс FBS и EDTA, как только что было продемонстрировано, объединив смыватели в 50-миллилитровую трубку со льдом. Наконец, дважды промойте лунку дополненным DPBS и переложите промывку в трубку, помещенную на лед.

На этом видео можно увидеть миграцию ослабленных радиацией спорозоеитов в кожу мыши через 15 минут после внутрикожного введения паразитов. Через 24 часа после внутрикожного введения спорозоитов общее количество клеток выделяется из кожи и дренирующего лимфатического узла. Как видно на этом рисунке, частота миелоидных клеток в коже и дренируемых лимфатических узлах значительно увеличена по сравнению с наивными мышами.

После освоения первые этапы протокола облучения комаров до введения спорозоита могут быть выполнены за четыре часа. При проведении этой процедуры важно помнить, что спорозоит, выделенный из слюнных желез комаров, быстро теряет свою инфекционность. Поэтому их нужно вводить как можно быстрее.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как изолировать миелоидные клетки из кожи мыши и дренировать лимфатический узел для изучения иммунного ответа на внутрикожное введение живых ослабленных паразитов Plasmodium.