Упрощенный метод для сверхнизкой плотности, Долгосрочное Первичный гиппокампа Нейрон культуры

Общая цель данной процедуры заключается в создании здоровых долгосрочных культур первичных гиппокампальных нейронов мыши при ультранизкой плотности для облегчения иммуноцитохимического мечения и изучения автономных механизмов нейрональных клеток. Данное исследование может помочь в решении некоторых ключевых вопросов в области нейробиологии, таких как изучение специфичности белков в нейроморфологии или функциях развития. Основным преимуществом данного метода является то, что он позволяет нейронам расти при ультранизкой плотности на покровном стекле без поддержки фидерного слоя глии.

Процедуру продемонстрирует Мариэль Пехович, студент моей лаборатории. Подготовьте два 24-луночных планшета для высокой плотности и два для низкой плотности. Используя иглу 28-го калибра, сделайте насечки на дне 24-луночных планшетов, чтобы смещенный пластик служил опорой для покровных стекол с растущими на них нейронами низкой плотности.

Перенесите стерильные стеклянные покровные стекла в две 24-луночные планшеты, предназначенные для культур низкой плотности. Покройте все четыре планшета 300 µL Poly-D-lysine в концентрации 0,1 mg/mL, разведенного в боратном буфере, и поместите их обратно в инкубатор для инкубационного покрытия на ночь. Перед сбором тканей подготовьте две чашки Петри диаметром 10 cm, заполненные ледяным стерильным HBSS.

Под микроскопом зажмите эмбрион за шею пинцетом и сделайте первый разрез точно по срединной линии ниже уровня мозжечка. Затем сделайте разрез с левой стороны основания черепа. После этого сделайте еще один разрез с правой стороны основания черепа.

Оставьте небольшую часть костей черепа и кожных тканей на ростральном конце неразрезанными, чтобы весь мозг можно было легко отодвинуть в сторону для извлечения. Теперь перенесите мозг в раствор HBSS. Осмотрите мозг, чтобы убедиться в его целостности и отсутствии грубых повреждений или отделенных участков.

Затем повторите данные процедуры, чтобы собрать остальные головные мозги эмбрионов в новую чашку Петри, содержащую 20 milliliters холодного буфера HBSS. Расположите каждый мозг вентральной стороной вверх. Придерживая мозг пинцетом за каудальный конец, сделайте острым пинцетом диагональный разрез между средней ростральной точкой и каудальной височной областью.

Повторите эту процедуру для другого полушария. После этого отделите оба полушария с неповрежденным гиппокампом от остальных тканей ствола мозга. Повторите данные действия для всех мозгов и объедините все выделенные полушария.

Затем удалите мозговые оболочки с помощью двух пар пинцетов. Идентифицируйте развивающийся гиппокамп как изогнутую структуру, свернутую внутри височной доли, и отделите его от прилегающих тканей коры. Соберите все ткани гиппокампа в одну общую пробу.

В данной процедуре перенесите все препарированные гиппокампы в раствор для ферментативного переваривания в коническую пробирку объемом 15 мл. Затем поместите пробирку в водяную баню и инкубируйте при 37 °C в течение 25 минут. По истечении 25 минут осторожно удалите раствор фермента.

Затем добавьте пять миллилитров теплой промывочной среды, чтобы довести общий объем до 10 миллилитров. Осторожно промойте ткань, медленно перевернув пробирку пять раз. Удалите промывочную среду и снова добавьте 10 миллилитров промывочной среды для дополнительного промывания.

После этого удалите промывочную среду и снова добавьте три миллилитра свежей теплой промывочной среды. Энергично встряхните пробирку вручную 15 раз, чтобы высвободить переваренные нейроны из ткани. Среда должна стать мутной, когда клетки отделятся от ткани и перейдут в промывочную среду.

Затем перенесите клеточную суспензию в новый конический центрифужный пробирку объемом 15 мл, оставив ткань в исходной пробирке. После этого добавьте к ткани еще два миллилитра промывочной среды и аккуратно раздробите оставшуюся ткань, 15 раз тритурируя ее пластической пипеткой. Оставьте клеточную суспензию на пять минут, после чего объедините ее с ранее собранными клетками в новой конической пробирке объемом 15 мл.

Затем определите плотность нейронов с помощью гемоцитометра. Рассчитайте объем клеточной суспензии, необходимый для получения плотности 250 000 нейронов на миллилитр, и добавьте его в одну из двух конических пробирок, содержащих 30 миллилитров полной культуральной среды, чтобы приготовить среду для посева нейронов высокой плотности. Перенесите 1,2 миллилитра этого раствора нейронов высокой плотности в еще 30 миллилитров полной культуральной среды, чтобы получить концентрацию 10 000 нейронов на миллилитр, и используйте данный раствор для посева на покровные стекла с низкой плотностью.

В данной процедуре поместите в стерильный бокс 24-луночные планшеты с травленым дном для нейронов высокой плотности. Удалите 300 µL предварительно кондиционированной среды с помощью вакуума, затем высейте 0,6 mL суспензии клеток высокой плотности из расчета 250 000 нейронов на 1 mL. Поместите в стерильный бокс два других 24-луночных планшета с покровными стеклами.

Удалите 300 µL предварительно кондиционированной среды с помощью вакуума, после чего нанесите на покровные стекла 0,6 мл суспензии клеток низкой плотности из расчета 10 000 нейронов на мл. Затем верните все четыре 24-луночные планшеты в инкубатор и инкубируйте в течение двух часов. После этого переверните покровные стекла с прикрепившимися нейронами низкой плотности на культуру высокой плотности, убедившись, что нейроны обращены друг к другу.

Затем верните две планшетки с кокультурой в инкубатор. На пятый день *in vitro* (DIV 5) подкормите кокультуры, добавив 300 µL свежей питательной среды. После этой первой подкормки еженедельно добавляйте в каждую лунку по 300 µL свежей питательной среды без цитозина арабинозида.

Если культуру необходимо поддерживать более одного месяца, каждую неделю после этого срока заменяйте половину среды свежей подпитывающей средой. Морфологически нейроны как высокой, так и низкой плотности должны выглядеть здоровыми в течение трех месяцев. В данном случае используется иммуноцитохимическое окрашивание для выявления функциональных глутаматергических синапсов, при котором субъединица NR1 NMDA-рецептора и субъединица GluR1 ApoE-рецептора визуализируются с помощью двойного окрашивания.

Функциональные синапсы можно легко идентифицировать и количественно оценить с помощью Image J. Нейроны низкой плотности также маркируют антителами к маркеру дендритного белка MAP2 в сочетании с маркером аксонального белка p-Tau. Такое двойное окрашивание позволяет четко отличить дендриты от аксонов. Культуры низкой плотности также могут быть успешно трансфектированы ДНК-плазмидами с использованием метода с фосфатом кальция, хотя эффективность трансфекции на поздних стадиях обычно очень низка.

На данном рисунке показано, что трансфекция EGFP позволяет выявить морфологию нейронов и сделать видимыми тонкие структуры дендритных шипиков. Наконец, в качестве подтверждения концепции, нейроны сверхнизкой плотности могут быть выращены в условиях, способствующих формированию аутопсов. Такие аутоптические нейроны сверхнизкой плотности, выращенные на микроостровках с покрытием из поли-D-лизина, могут поддерживаться высокоплотными фидерными нейронами более двух месяцев при использовании данного протокола совместного культивирования.

После освоения эта методика может быть выполнена за два-три часа в день работы с клеточной культурой при условии правильного проведения процедуры. При выполнении данной процедуры критически важно покрыть стеклянные покровные стекла и дно 24-луночного планшета поли-D-лизином. Простого травления дна планшета достаточно для обеспечения механической и трофической поддержки нейронов гиппокампа низкой плотности для их роста на покровных стеклах.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как выращивать первичные эмбриональные нейроны гиппокампа мыши с ультранизкой плотностью в отсутствие глиального фидерного слоя. Надеемся, что вы сможете использовать этот метод в своих собственных экспериментальных целях.