Упрощенный метод для сверхнизкой плотности, Долгосрочное Первичный гиппокампа Нейрон культуры

Общая цель этой процедуры заключается в создании здоровых долгосрочных культур первичных нейронов гиппокампа мыши со сверхнизкой плотностью, чтобы облегчить иммуноцитохимическое мечение и изучение автономных механизмов нейрональных клеток. Это исследование может помочь понять некоторые ключевые вопросы в области нейробиологических исследований, такие как исследования специфичности белка в нейроморфологии функции развития. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет нейронам расти со сверхнизкой плотностью на покровном листе без поддержки глиального питающего слоя.

Демонстрировать процедуру будет Мариэль Пехович, студентка из моей лаборатории. Подготовьте два планшета высокой плотности и два планшета низкой плотности на 24 лунки. С помощью иглы 28 калибра протравите дно пластин 24 лунки таким образом, чтобы смещенные пластики выступали в качестве опоры для покровных пластин с растущими на них нейронами низкой плотности.

Перенесите стерильную стеклянную крышку в два 24-луночных планшета, предназначенных для культур низкой плотности. Покройте все четыре планшета 300 микролитрами по 0,1 мг на миллилитр поли-D-лизином, разведенным в боратном буфере, и верните их в инкубатор для ночного инкубационного покрытия. Перед сбором тканей приготовьте две 10-сантиметровые чашки Петри, наполненные ледяным стерильным HBSS.

Под микроскопом держите эмбрион за шейку с помощью щипцов, а первый надрез сделайте прямо по средней линии, ниже уровня мозжечка. Впоследствии сделайте надрез с левой стороны основания черепа. Далее сделайте еще один надрез с правой стороны основания черепа.

Оставьте небольшую часть кости черепа и кожной ткани на ростральном конце необрезанной, чтобы весь мозг можно было легко отодвинуть в сторону для извлечения. Теперь перенесите мозг в раствор HBSS. Осмотрите мозг, чтобы убедиться, что он цел и не поврежден без грубых отсеченных участков.

Затем повторите процедуры, чтобы собрать остальные мозги эмбриона в новую чашку Петри, содержащую 20 миллилитров холодного буфера HBSS. Расположите каждый мозг вентральной стороной вверх. Удерживая мозг щипцами на каудальном конце, острым пинцетом сделайте надрез по диагонали между средней ростральной точкой и каудальной височной областью.

Повторите то же самое для другого полушария. После этого отделите два полушария с помощью неповрежденного гиппокампа от остальных стволовых тканей мозга. Повторите процедуры для всех мозгов и объедините все рассеченные полушария вместе.

Затем удалите мозговые оболочки с помощью двух пар пинцетов. Определите развивающийся гиппокамп как изогнутую структуру, которая свернута внутри височной доли и отделяет его от прилегающих тканей коры головного мозга. Соберите и объедините все ткани гиппокампа вместе.

При этой процедуре переложите все рассеченные гиппокампы в ферментативный раствор для пищеварения в конической трубке объемом 15 миллилитров. Далее поместите трубку на водяную баню и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 25 минут. Через 25 минут осторожно удалите ферментный раствор.

Затем добавьте пять миллилитров теплой умывальной среды, чтобы довести общий объем до 10 миллилитров. Аккуратно промойте салфетку, медленно перевернув трубку пять раз. Удалите средство для стирки и снова добавьте 10 миллилитров средства для стирки, для дополнительной стирки.

После этого удалите средство для умывания, и снова добавьте три миллилитра свежего теплого средства для умывания. Сильно встряхните трубку рукой 15 раз, чтобы вытеснить переваренные нейроны из ткани. Среда должна стать мутной после того, как клетки будут отделены от ткани в промывочную среду.

Затем соберите клеточную суспензию в новую 15-миллилитровую коническую трубку, оставив при этом оставшуюся ткань в трубке. После этого добавьте в салфетку еще два миллилитра промывочной среды, а оставшуюся ткань аккуратно отделите, растирая пластиковой пипеткой 15 раз. Дайте клеточной суспензии постоять в течение пяти минут, прежде чем объединить ее в новую 15-миллилитровую коническую трубку, которая содержит собранные стряхиваемые клетки.

Затем посчитайте плотность нейронов с помощью гемоцитометра. Рассчитайте объем клеточной суспензии, необходимый для получения плотности 250 000 нейронов на миллилитр, и добавьте его в одну из двух конических трубок, содержащих 30 миллилитров полной питательной среды, чтобы получить среду для покрытия нейронов высокой плотности. Перелейте 1,2 миллилитра этого раствора нейронов высокой плотности в другие 30 миллилитров полной питательной среды, чтобы получить концентрацию 10 000 нейронов на миллилитр, и используйте этот раствор для посева покровных листов низкой плотности.

В этой процедуре поместите 24-луночные планшеты с протравленным дном для нейронов высокой плотности в культуральный колпак. Удалите 300 микролитров предварительно кондиционированной среды с помощью вакуума, затем добавьте 0,6 миллилитра клеточной суспензии высокой плотности в соотношении 250 000 нейронов на миллилитр. Поместите два других 24-луночных планшета с крышками в колпак для культуры.

Удалите 300 микролитров предварительно кондиционированной среды с помощью вакуума, перед тем как нанести 0,6 миллилитра клеточной суспензии низкой плотности в соотношении 10 000 нейронов на миллилитр на покровные стекла. После этого верните все четыре 24-луночных планшета в инкубатор и инкубируйте в течение двух часов. После этого переверните покровные листы низкой плотности с прилипшими нейронами к культуре высокой плотности и убедитесь, что нейроны обращены друг к другу.

Впоследствии верните две тарелки с сокультурой в инкубатор. Подкармливайте сокультуры, добавляя 300 микролитров свежей кормовой среды в DIV 5. После этой первичной подкормки каждую неделю добавляйте в каждую лунку по 300 микролитров свежей кормовой среды без цитозина арабинозида.

Если культура хранится более одного месяца, заменяйте половину среды свежей кормовой средой каждую неделю по истечении одного месяца. Морфологически нейроны как высокой, так и низкой плотности должны выглядеть здоровыми до трех месяцев. В данном случае иммуноцитохемитрическое мечение используется для выявления функциональных глутаматергических синапсов, в которых субъединица NMDA-рецептора NR1 и субъединица ApoE-рецептора GluR1 помечены двойным окрашиванием.

Функциональные синапсы могут быть легко идентифицированы и количественно определены с помощью изображения J. Нейроны низкой плотности также помечены антителом против маркера дендритного белка MAP2 в сочетании с маркером аксонального белка p-Tau. Эта двойная маркировка позволяет четко различать дендриты и аксоны. Культуры с низкой плотностью также могут быть успешно трансфицированы ДНК-плазмидами с использованием методов фосфата кальция, хотя скорость трансфекции обычно очень низкая на более поздних стадиях.

Этот рисунок иллюстрирует, что трансфекция EGFP может выявить морфологию нейронов и сделать видимыми тонкие дендритные структуры шипиков. Наконец, в качестве доказательства концепции, нейроны сверхнизкой плотности могут быть выращены в условиях, способствующих образованию аутапса. Эти аутаптические нейроны сверхнизкой плотности, выращенные на микроостровках, покрытых поли-D-лизином, могут поддерживаться фидерными нейронами высокой плотности более двух месяцев с помощью этого протокола совместного культивирования.

После освоения эта техника может быть выполнена за два-три часа в день культивирования клеток, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру крайне важно покрыть стекла и днище 24-луночных планшетов поли-D-лизином. Простое травление нижней части пластины достаточно для обеспечения механической и питательной поддержки нейронов гиппокампа низкой плотности, которые растут на покровных листках.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выращивать первичные эмбриональные нейроны гиппокампа мыши сверхнизкой плотности при отсутствии глиального питающего слоя. Надеюсь, вы сможете использовать этот метод в своих собственных экспериментальных целях.