Методика Целевой показатель микроинъекции к проявляющему Xenopus почки

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы нацелить микроинъекции в развивающуюся почку ксенопуса. Этот метод может помочь решить ключевые вопросы в области биологии развития, такие как как формирование почки и какие гены важны для этого процесса. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она максимизирует доставку микроинъекционных реагентов в целевую ткань.

Визуализация этого метода важна, потому что определение правильного бластомера для целенаправленной микроинъекции имеет решающее значение. Чтобы начать эту процедуру, оба семенника были выделены от одного самца лягушки и помещены в 60-миллиметровую чашку Петри, заполненную 10 миллилитрами раствора для хранения семенников. Затем храните семенники при температуре четыре градуса по Цельсию.

Далее были собраны яйца от самки лягушки в 100-миллиметровой чашке Петри. Слейте лишнюю воду из чашки Петри. После этого отрежьте четверть семенника в Testes Storage Solution.

Переложите кусочек семенника в чашку Петри, в которой находятся яйца. Впоследствии нарежьте часть семенника на небольшие кусочки. Добавьте MMR плюс гентамицин в чашку Петри, чтобы покрыть яйца.

Смешайте их, поворачивая блюдо, а затем подождите примерно 30 минут, пока произойдет оплодотворение при комнатной температуре. После оплодотворения пигментированная сторона эмбрионов должна быть обращена вверх. Удалите MMR из чашки Петри с помощью переводной пипетки и добавьте достаточное количество раствора для удаления желе, чтобы покрыть эмбрионы.

После этого поворачивайте форму в течение следующих нескольких минут, чтобы растворить желейную оболочку на эмбрионах. Как только эмбрионы плотно соприкасаются друг с другом в центре чашки, желейная оболочка удаляется. Удалите раствор для удаления железа с помощью переводной пипетки.

Затем промойте очищенные эмбрионы от 3 до 5 раз в MMR плюс Гентамицин, осторожно вылив MMR и наполнив блюдо новым MMR. Не удаляйте всю MMR из чашки, так как это может повредить эмбрионы. После этого удалите все неоплодотворенные яйца или кусочки семенников из чашки Петри.

Чтобы замедлить их развитие, поместите половину эмбрионов от одного оплодотворения в чашку Петри при температуре 14 градусов Цельсия, а другую половину эмбрионов в чашку Петри при температуре 18 градусов Цельсия. Эмбрионы будут развиваться медленнее при 14 градусах Цельсия, чем при 18 градусах Цельсия. Возможность нескольких наборов впрысков из одной удобренной кладки.

Приготовьте раствор для инъекций, содержащий нулевую точку одного нанограмма на нанолитр мембранно-связанной мРНК красного флуоресцентного белка. Пока эмбрионы развиваются до 4-клеточной или 8-клеточной стадии. Держите раствор для инъекций на льду до использования.

Затем загрузите семидюймовую сменную стеклянную капиллярную трубку в съемник игл так, чтобы верхняя часть сменной трубки совмещелась с верхней частью корпуса съемника иглы. Установите значение теплоты номер два на 800, а значение натяжения на 650 и нажмите кнопку вытягивания, чтобы потянуть за иглу. После этого отрежьте кончик вытянутой иглы с помощью щипцов Дюмона.

Наденьте цангу для микропипетки на заднюю часть иглы. Затем наденьте уплотнительное кольцо с большим отверстием на заднюю часть иглы за цангой. Теперь наполните иглу минеральным маслом с помощью гипердермальной иглы 27 калибра, стараясь не допустить попадания пузырьков воздуха в иглу.

Наденьте иглу на поршень микроинжектора, посадив иглу в большое отверстие белой пластиковой прокладки, установленной на поршне. Закрепите иглу, затянув цангу. Далее нажмите и удерживайте кнопку «Пусто» на блоке управления микроинжектором до тех пор, пока не раздадутся два звуковых сигнала.

После этого нанесите пипеткой три микролитра раствора для инъекций на кусок парапленки. Затем вставьте кончик иглы в шарик инъекционного раствора на парапленке. Нажмите и удерживайте кнопку «Заполнить» на блоке управления микроинъектором, чтобы втянуть раствор для инъекции в иглу.

Перед микроинъекцией важно понять ранние клеточные деления эмбриона ксенопуса. Одноклеточный эмбрион имеет темный пигментированный животный полюс и вегетативный полюс, белый и желтоватый. У двухклеточного эмбриона первое расщепление обычно происходит между левой и правой сторонами эмбриона.

Эти клетки в равной степени вносят свой вклад в пронефрическую линию. Второе расщепление разделяет дорсальную и вентральную половины эмбриона, что приводит к 4-клеточному эмбриону. Дорсальные клетки меньше и имеют меньше пигмента, чем вентральные клетки.

При инъекции в 4-клеточный эмбрион введите левый вентральный бластомер, чтобы нацелиться на левую почку. Третья спайность делит пополам животную и растительную стороны. В результате получается 8-клеточный эмбрион.

На этом этапе есть четыре бластомера животных и четыре растительных бластомера. Чтобы нацелиться на левую почку 8-клеточного эмбриона, введите в левый вентральный вегетативный бластомер. Затем заполните 60-миллиметровую чашку Петри, выстланную полиэфирной сеткой толщиной 500 микрон, пятью процентами fycol в MMR плюс гентамицин.

Осторожно пипеткой внесите в чашку от 20 до 30 8-клеточных эмбрионов. С помощью петли для волос манипулируйте эмбрионами так, чтобы вводимый бластомер был обращен к игле. Чтобы нацелиться на левую почку, выровняйте эмбрионы так, чтобы левые вентральные вегетальные бластомеры 8-клеточных эмбрионов были обращены к игле.

Введите 10 нанолитров раствора для инъекций в выбранный бластомер каждого эмбриона в чашке. Затем перенесите введенные эмбрионы в лунки культивальной тарелки с пятипроцентным fycol в MMR плюс гентамицин. Инкубируйте введенные эмбрионы при температуре 16 градусов Цельсия в течение примерно одного-двух часов, чтобы введенные бластомеры зажили.

После этого перенесите микроинъекционные эмбрионы в новые лунки в культуральную тарелку, заполненную MMR плюс гентамицином. Инкубируйте эмбрионы при температуре от 14 до 22 градусов по Цельсию до тех пор, пока они не достигнут стадии от 38 до 40 градусов. При этой процедуре переносят от 10 до 20 стадий от 38 до 40 эмбрионов в стеклянный флакон.

Добавьте во флакон 10 микролитров пятипроцентного бензокаина в 100-процентном этаноле. Перемешайте, перевернув флакон, и подождите 10 минут, чтобы обезболить эмбрионы. Далее извлеките MMR из флакона и наполните его MEMFA.

Затем поместите его на трехмерную качающуюся платформу на один час при комнатной температуре. Через час извлеките MEMFA из флакона и наполните его 100-процентным метанолом. Затем поместите флакон на трехмерную качающуюся платформу на десять минут при комнатной температуре.

Повторите этот шаг промывки еще раз и храните эмбрионы в 100-процентном метаноле в течение ночи при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Теперь эмбрионы закреплены и готовы к иммуноокрашиванию. На этой схеме показано, какой бластомер следует ввести для нацеливания на левый пронефрос эмбрионов xenopus на 8-клеточной стадии с использованием мембранно-связанной мРНК красного флуоресцентного белка в качестве индикатора.

Локализация индикатора после инъекции в левом вентральном вегетальном бластомере показана красным цветом, в то время как почка помечена зеленым. На этом изображении видно, что почка была окрашена в зеленый цвет антителами 3G8 и 4A6. Вот крупный план области почки, показывающий лоакализацию индикатора, а вот объединенное изображение, показывающее совместную локализацию индикатора с почкой.

Здесь показано конфокальное изображение почки второго эмбриона, окрашенного 3G8 и 4A6. Это локализация красного индикатора в почке и окружающих тканях, а это объединенное изображение, показывающее совместную локализацию индикатора 3G8 и 4A6 в почке. Перед выполнением этой процедуры важно ознакомиться с эмбрионом xenopus на ранних стадиях.

Это позволит вам правильно нацелить микроинъекции через установленную карту затухания ксенопуса. После освоения этой техники ее можно адаптировать для воздействия на другие ткани, такие как нервная трубка или сердце.