Инкапсуляция цитохрома с Кремнеземом Aerogel Nanoarchitectures без металлических наночастицах при сохранении газофазных отпорности

Общей целью этой процедуры является инкапсуляция цитохрома с в силиковые золь-гели. Сверхкритическая обработка этих гелей с образованием биоаэрогелей и использование этих биоаэрогелей для быстрого распознавания оксида азота через реакцию в газовой фазе. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биосенсорики и биоанализа, например, какие условия необходимы для того, чтобы цитохром с оставался активным при инкапсуляции в высокопористый аэрогель?

Значение данного метода заключается в том, что он представляет собой простую процедуру инкапсуляции белка в матрицу, в которой белки часто не были успешно инкапсулированы. Хотя этот метод может дать представление о цитохроме с, он также может привести к процедурным разработкам для инкапсуляции других белков в аэрогели, что может иметь потенциальное значение для будущих биоаналитических устройств. Приготовьте раствор с концентрацией цитохрома с в диапазоне от 0,7 до миллимолара.

А также разведенный 0,105 миллимолярного раствора цитохрома с, как описано в текстовом протоколе. Затем наклейте этикетку на одноразовый полипропиленовый стакан объемом 50 миллилитров, стакан А. Поместите стакан на поддон аналитических весов и с помощью стеклянной пастеровской пипетки добавьте в стакан 1,88 грамма тетраметоксисилана. Обнулите баланс.

А затем пипеткой закачать 2,88 грамма метанола в стакан А. Накрыть стакан А парапленкой. Затем добавьте магнитную мешалку в одноразовый полипропиленовый стакан объемом 50 миллилитров с надписью Beaker B и поставьте на сковороду аналитические весы. Используйте стеклянную пипетку, чтобы добавить 0,75 грамма воды и 3,00 грамма метанола, прежде чем накрыть стакан B парапленкой.

Начните перемешивать содержимое стакана B на пластине для перемешивания в вытяжном шкафу. Затем с помощью шприца введите 5 микролитров от 28,0 до 30,0% раствора гидроксида аммония через парапленочную крышку в смесь, помешивая. Как только этот шаг будет завершен, добавьте содержимое стакана А в стакан Б. Перемешивайте смесь в течение 20 минут, пока она покрыта парапленкой.

Пока смесь диоксида кремния смешивается, приобретите от восьми до девяти полипропиленовых сцинтилляционных флаконов и соответствующих крышек. Накройте крышку флакона полиэтиленовой пленкой, чтобы создать плоскую поверхность для образования геля. И наденьте на него колпачок.

Убедитесь, что полиэтиленовая пленка остается неповрежденной внутри крышки. Выровняйте флаконы крышкой вниз на столе скамейки, а открытыми донышками — вверх. Затем вырежьте из парапленки кусочки, которыми будет накрываться каждый флакон.

По завершении смешивания золя добавьте 3 миллилитра зольной смеси в чистый одноразовый полипропиленовый стакан объемом 50 миллилитров. С помощью стеклянной пастеровской пипетки очень медленно капните 500 микролитров 0,105 миллимолярного раствора разбавленного цитохрома с боковой стороны стакана в смесь золя объемом 3 миллилитра в течение примерно одной минуты. Обязательно аккуратно перемешивайте смесь, добавляя цитохром с, чтобы избежать образования больших красных комков.

Пипеткой внесите 0,5 миллилитра полученного цитохрома c диоксидом кремния в каждую подготовленную форму. Также пипеткой нанесите 0,5 миллилитра оставшегося простого диоксида кремния в одну или две формы для использования в качестве контрольных образцов во время сверхкритического процесса сушки. Закройте лицевой стороной вверх отверстия формочек парапленкой и поставьте в холодильник на ночь, или минимум на 12 часов для получения золь-гелей.

Достаньте формочки из холодильника. Снимите парапленку с верхней части одной формы, содержащей цитохром с зольный гель, также снимите крышку и пищевую пленку снизу. Добавив в форму немного этанола из промывочной бутылки, используйте круглый дисковый конец поршня шприца, чтобы осторожно вытолкнуть гель из формы в чистый стеклянный сцинтилляционный флакон объемом 20 миллилитров, содержащий примерно 5 миллилитров этанола.

Повторяйте эту процедуру удаления геля до тех пор, пока все гели цитохрома с не будут добавлены во флакон, а все силикагели не будут добавлены в отдельный флакон. Затем наполните флаконы доверху этанолом. Закройте крышкой и храните при температуре от 2 до 8 градусов Цельсия.

Каждые четыре часа в течение дня достаньте гели из холодильника. Снимите крышки с гелей и замените их свежим этанолом. В течение дополнительных трех дней погрузите влажные зольные гели в ацетон, сцеживая и добавляя свежий ацетон три раза в день.

Охладите сушильный аппарат для критических точек до 10 градусов Цельсия, установив температуру подключенного термостата на восемь градусов Цельсия. Как только аппарат нагреется до 10 градусов Цельсия, проведите тест на герметичность устройства, как описано в текстовом протоколе. Убедившись, что аппарат не протекает, осторожно вылейте влажные гели из сцинтилляционных флаконов вместе с большей частью ацетона в три длинные секции передаточной лодки.

При необходимости добавьте еще ацетона, чтобы убедиться, что все гели полностью погружены в ацетон перед герметизацией лодки внутри устройства. Откройте заливной клапан аппарата, чтобы добавить углекислый газ. Наблюдая за погружением углекислого газа в днище аппарата через окно аппарата, откройте сливной клапан для выпуска ацетона в течение пяти минут.

Это просачивание ацетона на дно произойдет до того, как аппарат будет полностью заполнен углекислым газом. Поэтому держите заливной клапан открытым во время слива, чтобы аппарат продолжал наполняться. Затем закройте сливной клапан.

Держите заливной клапан слегка приоткрытым. Вначале стекающая смесь содержит воду, потому что ацетон не является безводным. Возможно замерзание, засорение и повышение давления в дренажной трубке.

При обнаружении засора закройте сливной клапан до тех пор, пока засор не растает. Через пять минут откройте сливной клапан еще на пять минут и отрегулируйте заливной клапан так, чтобы он был достаточно открыт, чтобы аппарат оставался полным в течение всего времени слива. Через пять минут закройте сливной клапан и держите заливной клапан открытым.

Затем повторите этот шаг дренирования еще раз, через пять минут. После завершения этапов слива закройте заливной клапан и слейте жидкий углекислый газ так, чтобы уровень оставался видимым прямо над зубцами на лодке через окно аппарата. Затем установите температуру прилагаемого к аппарату термостата на 40 градусов Цельсия, чтобы гарантировать, что жидкий углекислый газ поднимется выше своей критической температуры и давления.

Примерно через 15 минут наблюдайте за переходом от жидкой к сверхкритической жидкости через окно аппарата, когда жидкий мениск над зубцами лодки исчезает. По прошествии не менее 15 минут уравновешивания откройте вентиляционный клапан на небольшое количество, чтобы начать выпуск сверхкритической жидкости. В течение примерно 45 минут продолжайте постепенно открывать вентиляционный клапан все шире и шире, чтобы можно было слышать ровное, но очень низкое шипение выходящей жидкости, а также наблюдать, как манометр медленно снижается до нуля.

После того, как давление аппарата ушло на ноль, откройте дверцу аппарата. Снимите лодку. И с помощью щипцов поместите только что высушенные аэрогели в чистые стеклянные сцинтилляционные флаконы.

Аэрогели цитохрома с силикатом теперь готовы к использованию для обнаружения присутствия газообразного оксида азота после определения характеристик, как описано в текстовом протоколе. Показано, что аэрогели, инкапсулирующие 15 микромолярный цитохром с в 4,4 миллимолярный, 40 миллимолярный и 70 миллимолярный буфер калийфосфатного буфера, сравниваются с десятицентовиком. Здесь показаны репрезентативные спектры цитохрома с в буфере по сравнению с цитохромом с, инкапсулированным в аэрогели в различных условиях.

Пик цитохрома с соре на 409 нанометрах остается практически несмещенным в аэрогелях и дает характерное красное смещение, когда биоаэрогели подвергаются воздействию оксида азота в газовой фазе. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как синтезировать зольные гели кремнезема, инкапсулировать цитохром с в эти зольные гели и сушить эти композитные зольные гели в аэрогелях. Более подробную информацию можно найти в текстовом протоколе по определению характеристик биоаэрогелей и использованию биоаэрогелей для обнаружения оксида азота в газовой фазе.