Инкапсуляция цитохрома

Общая цель данной процедуры заключается в инкапсулировании цитохрома c в золь-гель матрицах Silical. Далее следует сверхкритическая обработка этих гелей для получения биоаэрогелей, которые затем используются для быстрого распознавания оксида азота посредством газофазной реакции. Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области биосенсорики и биоаналитики, например, какие условия необходимы для сохранения активности цитохрома c при его инкапсулировании в высокопористом аэрогеле?

Значимость данного метода заключается в том, что он представляет собой простую процедуру инкапсуляции белка в матрицу, в которой успешная инкапсуляция белков ранее встречалась редко. Хотя этот метод может дать ценную информацию о цитохроме c, он также может способствовать разработке процедур инкапсуляции других белков в аэрогели, что может иметь важное значение для будущих биоаналитических устройств. Приготовьте раствор с концентрацией Cytochrome c в диапазоне от 0,7 до millimolar.

Также потребуется разбавленный 0,105 мМ раствор цитохрома c, как описано в текстовом протоколе. Затем промаркируйте одноразовый полипропиленовый стакан объемом 50 мл как «Стакан А». Поместите стакан на чашу аналитических весов и с помощью стеклянной пастеровской пипетки добавьте в стакан 1,88 г тетраметоксисилана. Обнулите весы.

Затем с помощью пипетки перенесите 2,88 граммов метанола в стакан А. Закройте стакан А парафильмом. Затем поместите магнитный перемешивающий элемент в одноразовый полипропиленовый стакан объемом 50 миллилитров с маркировкой «стакан Б» и установите его на чашу аналитических весов. С помощью стеклянной пипетки добавьте 0,75 граммов воды и 3,00 граммов метанола, после чего закройте стакан Б парафильмом.

Начните перемешивание содержимого стакана B на магнитной мешалке внутри вытяжного шкафа. Затем с помощью шприца введите 5 µL 28,0–30,0% раствора гидроксида аммония через покрытие из парафильма в смесь при перемешивании. Сразу после завершения этого этапа перелейте содержимое стакана A в стакан B. Перемешивайте смесь в течение 20 минут, оставив стакан закрытым парафильмом.

Пока смесь золя кремнезема перемешивается, возьмите восемь или девять полипропиленовых флаконов для сцинтилляции с соответствующими крышками. Накройте верхнюю часть флакона пищевой пленкой, чтобы создать плоскую поверхность для формирования геля, и закройте её крышкой.

Убедитесь, что пластиковая пленка остается целой внутри колпачка. Расположите пробирки на лабораторном столе колпачками вниз, открытым дном вверх. Затем нарежьте кусочки парафильма, которые будут использоваться для закрытия каждой пробирки.

После завершения смешивания золя перенесите 3 миллилитра смеси золя в чистый одноразовый полипропиленовый стакан объемом 50 миллилитров. С помощью стеклянной пастуровской пипетки очень медленно, в течение примерно одной минуты, добавьте 500 микролитров разбавленного раствора цитохрома c с концентрацией 0.105 миллимоляр, опуская капли по стенке стакана в 3 миллилитра смеси золя. Во время добавления цитохрома c осторожно перемешивайте смесь круговыми движениями, чтобы предотвратить образование крупных красных комков.

Перенесите пипеткой 0,5 мл полученного золя цитохрома c в каждую подготовленную форму. Также перенесите 0,5 мл оставшегося чистого золя кремнезема в одну или две формы для использования в качестве контрольных образцов в процессе сверхкритической сушки. Закройте верхние отверстия форм парафильмом и поместите в холодильник на ночь или минимум на 12 часов для формирования золь-гель соединений.

Достаньте формы из холодильника. Снимите парафильм с верхней части одной формы, содержащей золь-гель цитохрома c, также снимите крышку и пластиковую пленку с нижней части. Добавив немного этанола из промывочной бутылки в форму, используйте круглый конец поршня шприца, чтобы осторожно вытолкнуть гель из формы в чистую стеклянную сцинтилляционную пробирку объемом 20 миллилитров, содержащую примерно 5 миллилитров этанола.

Повторяйте эту процедуру извлечения геля до тех пор, пока все гели с цитохромом c не будут помещены в один флакон, а все силикагели — в отдельный флакон. Затем заполните флаконы этанолом доверху. Закройте крышками и храните при температуре от 2 до 8 degrees celsius.

Каждые четыре часа в течение дня извлекайте гели из холодильника. Слейте этанол с гелей и замените его свежим этанолом. В течение следующих трех дней погружайте влажные золь-гель образцы в ацетон, сливая его и добавляя свежий ацетон три раза в день.

Охладите установку для сушки в критической точке до 10 °C, установив температуру подключенного циркулятора на 8 °C. Как только аппарат достигнет 10 °C, проведите проверку установки на герметичность, как описано в текстовом протоколе. Убедившись в отсутствии утечек, осторожно перенесите влажные гели из сцинтилляционных пробирок вместе с большей частью ацетона в три длинных секции переносного лотка.

При необходимости добавьте больше ацетона, чтобы все гели были полностью погружены в ацетон перед герметизацией лодочки внутри аппарата. Откройте выпускной клапан аппарата, чтобы подать углекислый газ. Когда через смотровое окно будет видно, что углекислый газ опускается на дно аппарата, откройте сливной клапан для выпуска ацетона в течение пяти минут.

Просачивание ацетона ко дну произойдет до того, как аппарат будет полностью заполнен диоксидом углерода. Поэтому во время слива держите заливной клапан открытым, чтобы заполнение аппарата продолжалось. Затем закройте сливной клапан.

Держите заправочный клапан слегка приоткрытым. В начале процесса слива смесь содержит воду, так как ацетон не является безводным. Возможно замерзание, засорение и повышение давления в сливной трубке.

При обнаружении засора закройте сливной клапан до тех пор, пока засор не расплавится. Через пять минут откройте сливной клапан еще на пять минут и отрегулируйте заполняющий клапан так, чтобы он был открыт достаточно для того, чтобы аппарат оставался полным в течение всего времени слива. По истечении пяти минут закройте сливной клапан, оставив заполняющий клапан слегка приоткрытым.

Затем повторите этот этап слива еще раз через пять минут. По завершении этапов слива закройте заливной клапан и слейте жидкий углекислый газ таким образом, чтобы его уровень оставался видимым чуть выше зубцов лодочки через окно прибора. Затем установите температуру подключенного к прибору циркулятора на 40 °C, чтобы жидкий углекислый газ превысил свою критическую температуру и давление.

Примерно через 15 минут через смотровое окно аппарата пронаблюдайте переход из жидкого состояния в сверхкритический флюид по исчезновению мениска жидкости над зубцами лодочки. После выдерживания в состоянии равновесия в течение не менее 15 минут немного откройте вентильный клапан, чтобы начать выпуск сверхкритического флюида. В течение примерно 45 минут продолжайте постепенно открывать вентильный клапан все шире, пока не станет слышен устойчивый, но очень тихий свист выходящего флюида, и пока стрелка манометра медленно не опустится до нуля.

После того как давление в аппарате упадет до нуля, откройте дверцу аппарата. Извлеките лодочку. С помощью пинцета перенесите высушенные аэрогели в чистые стеклянные сцинтилляционные флаконы.

Силикатные аэрогели с цитохромом c теперь готовы к использованию для обнаружения оксида азота (NO) после проведения характеризации, описанной в текстовом протоколе. На изображении представлены аэрогели, инкапсулирующие 15 µM цитохрома c в калий-фосфатном буфере с концентрацией 4,4 mM, 40 mM и 70 mM, в сравнении с монетой. Здесь приведены репрезентативные спектры цитохрома c в буфере в сравнении с цитохромом c, инкапсулированным в аэрогели при различных условиях.

Пик Соре цитохрома c при 409 нанометрах остается практически неизменным внутри аэрогелей и демонстрирует характерный красный сдвиг при воздействии на биоаэрогели газообразного оксида азота. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как синтезировать золь-гели из диоксида кремния, инкапсулировать цитохром c в эти золь-гели и высушить полученные композитные золь-гели до состояния аэрогелей. Дополнительную информацию можно найти в текстовом протоколе по характеризации биоаэрогелей и их использованию для детектирования газообразного оксида азота.