Feeder-свободный Вывод меланоцитов из человеческих плюрипотентные стволовые клетки

Общая цель данного протокола заключается в дифференцировке плюрипотентных стволовых клеток человека в полностью пигментированные зрелые меланоциты. Этот метод может помочь выявить ключевые факторы развития меланоцитов. Кроме того, данный протокол позволит идентифицировать факторы, нарушения которых привели к развитию заболевания, а также проводить скрининг важных препаратов в процессе поиска и разработки лекарственных средств.

Основным преимуществом данного протокола является возможность получения большого количества полностью пигментированных меланоцитов. В то время как выделение меланоцитов из тканей пациентов обычно приводит к получению относительно небольшого числа клеток. После распределения по аликвотам и замораживания желатинового белка разморозьте и ресуспендируйте одну аликвоту объемом 1 мл в 19 мл DMEM f12.

Затем внесите пять миллилитров этой смеси в одну чашку для культивирования тканей диаметром 10 сантиметров. Подготовив несколько таких чашек, инкубируйте их в течение одного часа при комнатной температуре. Далее приступите к подготовке чашек, покрытых PO, ламинином и фибронектином, сначала добавив в чашку для культивирования PBS, содержащий 15 микрограмм на миллилитр PO.

Затем инкубируйте планшеты в течение ночи при 37 °C в увлажненном инкубаторе. После этого аспирируйте раствор и трижды промойте чашки 1X PBS. Продолжите покрытие, добавив 10 mL PBS, содержащего 1 µg/mL ламинина 1 мыши и 2 µg/mL фибронектина.

Затем инкубируйте чашки, как было описано ранее. Для начала добавьте 0,1% желатина в PBS в чашку диаметром 10 сантиметров. Оставьте ее при комнатной температуре на пять минут.

Пока планшет покрывается желатином, поместите замороженные эмбриональные фибробласты мыши (MEF) в водяную баню при 37 °C для их быстрого размораживания. Затем удалите желатин из чашки аспирацией и высейте MEF с плотностью примерно 50 000 клеток на см² в среде DMEM, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки. После инкубации чашки в течение ночи при 37 °C удалите среду и промойте подготовленный планшет с MEF 1X PBS.

Добавьте 10 миллилитров предварительно приготовленной среды для hESC, содержащей человеческие плюрипотентные стволовые клетки (сокращенно hPSCs), в чашку диаметром 10 сантиметров. После посева клеток с плотностью 5 миллионов клеток на чашку инкубируйте планшеты при 37 градусах Цельсия в атмосфере пяти процентов углекислого газа. Далее ежедневно подпитывайте клетки, добавляя 10 миллилитров свежей среды для hESC.

Перед началом дифференцировки осмотрите планшет на наличие колоний, которые выглядят как содержащие дифференцированные клетки, имеют неровные края или прозрачные центры. Под диссекционным микроскопом в ламинарном шкафу механически удалите такие неправильные колонии с помощью пипетки. Для проведения покрытия желатиновым белком, таким как Matrigel, сначала разделите белок на аликвоты по 1 ml и заморозьте их, чтобы избежать повторных циклов замораживания-оттаивания.

Затем разморозьте и ресуспендируйте одну замороженную аликвоту объемом 1 мл в 19 мл среды DMEM f12. Перенесите 5 мл этой смеси в чашку диаметром 10 см и инкубируйте чашки в течение одного часа при RT. После этого, непосредственно перед посевом клеток, аспирируйте желатиновый белок и промойте среду DMEM F12. Пока чашка покрывается, выберите планшет, в котором hPSCs достигли примерно 80% конфлюэнтности.

Проведите аспирацию среды hESC. Затем промойте клетки раствором PBS. После удаления PBS добавьте в планшет три миллилитра 0,05% trypsin-EDTA.

Интенсивно встряхивайте чашку по горизонтали в течение двух минут до тех пор, пока под микроскопом не станет видно, что MEF начинают отделяться в виде одиночных клеток. В течение этого времени колонии hPSC должны оставаться прикрепленными к планшету. После того как MEF отделятся, но до того, как открепятся колонии hPSC, аспирируйте трипсин.

Затем в планшет добавьте 10 миллилитров среды для hESC, содержащей 10 микромоляр Y-27632 дигидрохлорида, ингибитора ROCK. После этого отделите клетки, несколько раз пропустив среду через пипетку над колониями. Затем перенесите их обратно в чашку с желатиновым белком и аспирируйте раствор.

Промойте данную лунку средой DMEM f12, чтобы удалить все агрегаты. Затем высейте в нее hPSCs в соотношении от 1 до 2. После этого добавьте в лунку среду для hESC, содержащую 10 µM дигидрохлорида Y-27632, до общего объема 10 mL.

Инкубируйте клетки при 37 °C в течение ночи. Ежедневно подкармливайте клетки средой с добавлением ингибитора ROCK. Когда hPSCs достигнут 80% конфлюэнтности, приступите к инициации нейральной дифференцировки и обозначьте этот момент времени как День 0.

Для начала дифференцировки в День 0 и День 1 добавьте клеткам 10 миллилитров среды для дифференцировки KSR, содержащей 100 наномоляр LDN-193189 (ингибитор MP) и 10 микромоляр SB 431542 (ингибитор активина и Nodal). Продолжите в День 2, заменив среду на среду с теми же концентрациями BNP, ингибиторов активина и Nodal, а также с добавлением трех микромоляр CHIR99021 (агонист Wnt). Затем, в День 3, добавьте клеткам среду для дифференцировки KSR, дополненную только 10 микромоляр SB 431542 и тремя микромоляр CHIR99021.

После приготовления смеси из 75% дифференцировочной среды KSR и 25% дифференцировочной среды N2, содержащей 3 µM агониста Wnt, добавьте клеткам 15 мл этой жидкости на 4-й и 5-й дни. Затем, на 6-й и 7-й дни, добавьте клеткам 15 мл среды, состоящей из 50% дифференцировочной среды KSR и 50% дифференцировочной среды N2, с добавлением 3 µM CHIR99021, 25 ng/mL BMP4 и 100 nM EDN3.

Затем на 8-й и 9-й дни подкормите клетки 20 миллилитрами дифференцировочной среды, состоящей из 25% KSR и 75% N2, с добавлением факторов в тех же концентрациях, что использовались на 6-й и 7-й дни. Продолжите нейрональную дифференцировку на 10-й день, добавив клеткам 20 миллилитров дифференцировочной среды N2, содержащей 3 µM CHIR99021, 25 ng/mL BMP4 и 100 nM EDN3. На 11-й день аспирируйте раствор из чашек, предварительно покрытых ламинином 1 и фибронектином.

Затем оставьте планшеты открытыми в ламинарном шкафу для कल्चर клеток примерно на 10–15 минут до полного высыхания. Перейдите к удалению среды из клеток 11-го дня и промойте их PBS. Затем добавьте в чашку четыре миллилитра раствора для отсоединения клеток и инкубируйте ее при 37 °C в течение 25 минут.

После инкубации добавьте в чашку пять миллилитров полной среды для меланоцитов. Ресуспендируйте клетки путем ручного пипетирования вверх-вниз до тех пор, пока они не открепятся от поверхности планшета. Перенесите суспензию в пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте клетки в течение пяти минут при 200 Gs. После подсчета клеток с помощью метода исключения трипанового синего и гемоцитометра ресуспендируйте их в полной среде для меланоцитов до плотности 2X10⁶ клеток на миллилитр.

Нанесите капли клеточной суспензии объемом 10 µL на высушенные покрытые планшеты. Убедитесь, что капли расположены близко друг к другу, но не соприкасаются, имеют четкие края и не растекаются. Для обеспечения адгезии клеток оставьте капли при комнатной температуре на 10–20 минут.

После этого медленно добавьте в чашку 10 milliliters полной среды для меланоцитов, стараясь не потревожить прикрепившиеся клетки. Затем перенесите чашку в инкубатор. Сменяйте среду в культуре клеток каждые два-три дня, используя полную среду для меланоцитов.

К концу первой недели ожидается появление пигментации в группах клеток. Раз в неделю проводите пассирование клеток, предварительно обработав их раствором для открепления клеток, как описано ранее. После сбора и центрифугирования клеток промойте их дважды обычной нейробазальной средой.

Затем пересадите клетки в соотношении 1:6 в полную среду для меланоцитов в чашки, покрытые PO, ламинанином 1 и фибронектином. Примерно через 30 дней дифференцировки клетки станут глубоко пигментированными, что легко визуализируется при посеве с высокой плотностью или при центрифугировании в осадок во время пассирования.

Здесь представлено изображение клеток трансгенной линии эмбриональных стволовых клеток человека psox10 GFP, культивируемых до 11-го дня описанного протокола дифференцировки перед перепосевом клеток. В этих культурах заметны темные четко выраженные гребни клеток. При анализе данных культур на сигнал GFP было установлено, что в темных гребнях обогащены клетки, положительные по sox10.

Поскольку sox10 является фактором транскрипции, экспрессия которого повышается в стволовых клетках нервного гребня и поддерживается в меланобластах, эти результаты позволяют предположить, что к 11-му дню данный метод дифференцировки привел к обогащению культуры клетками, которые в конечном итоге дадут начало меланоцитам. В подтверждение этого, к 20-му дню протокола в культурах присутствовали непигментированные, созревающие и полностью зрелые пигментированные меланоциты. На 25-й день в культурах наблюдаются те же типы клеток.

Наличие созревающих и пигментированных меланоцитов в данных препаратах подтверждается окрашиванием на два белка, участвующих в продукции меланина. TYRP2, который служит маркером как меланобластов, так и меланоцитов, и TYRP1, который является маркером поздней стадии развития меланоцитов и экспрессируется здесь только в пигментированных меланоцитах. После освоения данный протокол может быть использован для дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток человека в полностью пигментированные зрелые меланоциты за 25 дней.

Протокол воспроизводит нормальное развитие меланоцитов, проходя сначала через состояние нейрального гребня, а затем через стадию меланобластов.