Качественный и количественный анализы для обнаружения и определения характеристик белка Противомикробные

Общая цель этих экспериментов заключается в быстром скрининге и характеристике ферментов на антимикробную активность. Анализ диффузии микрослайдов и высвобождения красителей полезен для функционального открытия новых противомикробных препаратов с литической активностью против конкретных мишеней, таких как представляющие интерес патогенные бактерии. Основные преимущества этих методов заключаются в том, что они просты в исполнении, обеспечивают гибкость для изменения экспериментальных параметров и могут быть выполнены с помощью лабораторного оборудования, которое обычно используется в большинстве микробиологических лабораторий.

Перед началом анализа микрослайдовой диффузии концентрация измеряемого антимикробного фермента должна быть определена с помощью набора для анализа белка BCA в соответствии с протоколом производителя. Выполните последовательное разведение антимикробного фермента, используя PBS в качестве реакционного буфера. Распределите белок по отдельным микропробиркам и отрегулируйте объем до 20 миллилитров с помощью PBS.

Далее приготовьте 0,5%-ный раствор агарозы, растворив 0,25 грамма агарозы в 50 миллилитрах PBS. Нагрейте этот раствор до кипения до полного растворения агарозы. Определите потери воды в процессе плавления по весу и добавьте обратно в раствор.

Чтобы подавить рост загрязняющих бактерий во время инкубации анализа, добавьте в раствор агарозы 15 микролитров 10%-ного азида натрия в воде и отрегулируйте температуру раствора до 50 градусов Цельсия на водяной бане. Если в качестве субстрата используются жизнеспособные клетки, из раствора агарозы исключите азид натрия. Разморозьте убитый теплом бактериальный субстрат на льду.

Ресуспендируйте бактериальный субстрат в 12 миллилитрах раствора агарозы, чтобы примерно соответствовать мутности стандарта мутности, эквивалентной 2,0 по Макфарланду. Сравните мутность растворов, визуализируя черную линию на белом фоне через растворы, добавляя бактериальный субстрат в агарозу до тех пор, пока не будет достигнута приблизительная мутность. Немедленно, но осторожно, нанесите пипеткой по три миллилитра раствора агарозного субстрата на каждую микрогорку, следя за тем, чтобы раствор не переполнил микрогорку.

После того, как предметные стекла затвердеют, с помощью пробкового сверла диаметром 4,8 миллиметра пробивите три отверстия в слое агарозной подложки каждого микропредметного стекла. Добавьте по 20 микролитров каждого отрегулированного серийного разведения белка в соответствующие лунки. Используйте бычий сывороточный альбумин в отрицательной контрольной лунке.

В качестве положительного контроля используйте известные бактериолитические ферменты, подходящие для субстрата, такие как лизоцим. Инкубируйте предметные стекла в камере влажности при температуре 37 градусов Цельсия, или оптимальной температуре активности фермента. Продолжительность инкубации зависит от концентрации и специфической активности антимикробного фермента.

Типичное время реакции составляет примерно 16 часов. Когда инкубация будет завершена, рассмотрите предметные стекла под непрямым светом и сделайте снимки развивающегося анализа. Используйте цифровой однообъективный зеркальный фотоаппарат с 60-миллиметровым объективом на фокусном расстоянии примерно 30 сантиметров.

В анализе высвобождения красителя, который будет продемонстрирован в следующем сегменте, субстрат ковалентно связан с красителем Remazol Brilliant Blue R или RBB. Начните этот протокол с изготовления 200 миллимолярного раствора RBB. Растворите 1,25 грамма RBB в свежеприготовленном растворе гидроксида натрия.

Далее ресуспендируют убитые теплом бактериальные клетки в концентрации 0,5 грамма сырого веса в 30 миллилитрах раствора RBB. Для очищенного пептидогликана ресуспендировать пептидогликан в концентрации 0,3 грамма сырого веса в 30 миллилитрах раствора RBB. Поскольку последующие шаги одинаковы, независимо от используемого субстрата, мечение будет продемонстрировано только для бактериальных клеток.

Инкубируйте реакционную смесь на вращающейся платформе в течение шести часов при температуре 37 градусов Цельсия с помощью осторожного перемешивания. Через шесть часов перенесите реакционную смесь в инкубатор с температурой четыре градуса Цельсия и инкубируйте еще 12 часов при бережном перемешивании. Когда инкубация будет завершена, соберите окрашенный субстрат центрифугированием при давлении 3000 x g в течение 30 минут.

Сцедите раствор красителя из гранул субстрата. Тщательно суспендируйте гранулу в воде типа I с последующим центрифугированием. Таким образом, полейте помеченные красителем клетки от трех до пяти раз, чтобы удалить нековалентно связанный растворимый краситель с субстратов.

Для заключительных промывок переложите часть гранул, которая будет использоваться в анализе высвобождения красителя, в микропробирки объемом 1,5 миллилитров. Надосадочная жидкость последней промывки должна быть прозрачной, при этом основание остается синим. Храните окрашенный субстрат во взвешенном состоянии в минимальном количестве воды при температуре 20 градусов Цельсия до тех пор, пока он не будет готов к использованию.

Чтобы подготовиться к анализу высвобождения красителя, дайте замороженному окрашенному субстрату вернуться к комнатной температуре и дважды промойте буфером для анализа, который был эмпирически определен для фермента. В этом случае используется PBS. Рассчитайте объем необходимой суспензии субстрата, умножив объем реакции 200 микролитров на количество анализов выделения красителя, которые должны быть выполнены.

Чтобы приготовить суспензию субстрата, сначала добавьте окрашенный субстрат до соответствующего объема PBS. Произведите разведение один к одному, и произведите первичное измерение оптической плотности на 595 нанометрах, используя PBS в качестве заготовки. Добавляйте в суспензию постепенное количество окрашенной подложки до тех пор, пока не будет достигнута оптическая плотность 2,0 на 595 нанометрах.

В этой демонстрации анализ высвобождения красителя будет использоваться для определения оптимальных условий инкубации белкового противомикробного препарата. Во-первых, приготовьте стоковую белковую антимикробную суспензию, регулируя концентрацию до одного миллиграмма на миллилитр с помощью PBS, как описано в тексте протокола. Затем разведите стоковый белок антимикробной суспензии до концентрации 100 нанограмм на микролитр.

Эта концентрация дает конечную реакционную массу в один микрограмм белка на объем, добавленный в реакцию анализа. Проведите анализ реакции в пробирках с микрофугой объемом 0,5 миллилитра для оценки теплового диапазона. Для каждого термического условия добавьте 10 микролитров исходного белка в 200 микролитров приготовленной суспензии субстрата.

Инкубировать в термоамплификаторе в течение восьми часов с перемешиванием методом инверсии один раз в час. После инкубации остановите реакции, добавив по 25 микролитров этанола в каждую микрофугированную пробирку. Чтобы удалить непереваренный нерастворимый субстрат, центрифугируйте при 3000 х г в течение двух минут.

После этого, стараясь не нарушить гранулу непереваренного субстрата, перенесите 150 микролитров надосадочной жидкости для каждой реакционной смеси на 96-луночный микропланшет с плоским дном. Чтобы количественно оценить ферментативную активность, используйте микропланшетный спектрофотометр для измерения поглощения надосадочной жидкости на 595 нанометрах. Повышенная абсорбция растворимым красителем, высвобождаемым в надосадочную жидкость из меченого субстрата, является количественным измерением ферментативной активности.

Анализ диффузии микрослайдов был использован для качественной оценки активности неизвестного белка антимикробного средства в отношении цельноклеточного субстрата Salmonella enterica, убитого теплом. Противомикробный препарат добавляли в возрастающих количествах из скважин от A до F, а PBS использовали для отрицательного контроля. Через шесть часов был замечен размер чистой зоны гидролиза, которая формировалась вокруг каждой скважины.

Высокая ферментативная активность качественно относится к большей зоне, в то время как низкая ферментативная активность качественно относится к меньшей зоне. Количественный анализ высвобождения красителя был использован для определения оптимальной температуры реакции для белкового противомикробного препарата. Как видно из количества синего цвета в надосадочной жидкости реакции и единиц активности, полученных в результате измерений поглощения на 595 нанометрах, 35 градусов Цельсия является оптимальной температурой.

Анализ высвобождения красителя также был использован для определения диапазона активности неизвестного белка антимикробного в отношении субстрата Bacillus subtilis, убитого при нагревании. Сравнение с диапазоном активности альфа-химотрипсина показало, что неизвестный антимикробный фермент имеет почти в два раза большее сродство к субстрату. Кроме того, в то время как активность альфа-химотрипсина начинает стабилизироваться на уровне около 0,3 мкг, активность неизвестного фермента продолжает расти во всех количествах фермента.

После освоения микродиффузионный анализ может быть завершен в течение 30 минут. Анализ высвобождения красителя может быть завершен в течение одного часа. Время инкубации для каждого анализа будет зависеть от активности ферментов и их концентрации.

Расширяя эти процедуры, метод высвобождения красителя может быть модифицирован для определения химических воздействий, влияющих на ферментативную активность антимикробного фермента, путем манипулирования такими аспектами реакции, как pH буфера и соленость. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как быстро провести скрининг и охарактеризовать ферменты на антимикробную активность с помощью анализов диффузии микрослайдов и высвобождения красителей.