Механизм регулирования адипоцитов числа в взрослом организме через дифференциацию и Апоптоз гомеостаза

Общие цели этих экспериментов заключаются в анализе гомеостаза и дифференцировки адипоцитов, а также в исследовании механизмов гипоксии и апоптоза адипоцитов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области метаболики, такие как ожирение и диабет II типа. Основное преимущество данной методики заключается в том, что они являются базовыми и недорогими процедурами заключается в том, что анализ биологии адипоцитов в вашей конкретной модели исследования.

Николь Ханнеманн, аспирантка из моей лаборатории, продемонстрирует процедуры. Чтобы количественно оценить гипоксию in vivo, сначала определите массу тела мыши. Затем внутрибрюшинно вводят 60 мг на кг массы тела твердого пимонидазола гидрохлорида.

Через 45 минут пришпильте конечности животного и откройте брюшную полость. Соберите левый и правый перигонадные жировые пакеты из полости и удалите гонадные ткани из полости. Затем взвесьте ткань, чтобы определить соотношение жировой подушки к массе тела в граммах.

Для проведения гистологического анализа гомеостаза адипоцитов сначала депарафинизируют участки жировой ткани с помощью трех пятиминутных промываний в ксилоле, затем следуют две двухминутные регидратации в 100% этаноле и две двухминутные регидратации в 96% этаноле. Затем промойте срезы в дистиллированной воде в течение пяти минут и окрасьте их гематоксилином на 10 минут при комнатной температуре. По окончании инкубации срезы промыть в воде еще пять минут с последующим 30-секундным окрашиванием раствором эозина.

Вымойте срезы так, как только что показано. Затем обезвожьте срезы в 96% этаноле и 100% этаноле два раза в течение двух минут. Затем следуют три пятиминутные инкубации ксилола.

Затем смонтируйте секции с помощью безводного монтажного агента. Для иммуногистохимического анализа ткани депарафинизируют срезы, как показано выше, с последующим 30-минутным разложением рабочим раствором протеиназы К при температуре 37 градусов Цельсия. В конце разложения промойте ткани в PBS и блокируйте эндогенную пероксидазу 3% перекисью водорода в PBS на 10 минут.

После двух последующих пятиминутных полосканий в PBS блокируют связывание любых неспецифических антител с 10% сывороткой в PBS. Затем инкубируйте ткани и интересующие антитела при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи. На следующее утро промойте пряди тремя пятиминутными стирками в PBS.

Затем инкубируйте ткани с соответствующими биотинилированными вторичными антителами в течение одного часа при комнатной температуре. В течение последних 30 минут периода мечения вторичными антителами уравновесить 50 микролитров раствора авидина с 50 микролитрами биотинилированной пероксидазы Н на секцию в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем промойте срезы два раза по пять минут каждый в PBS и обработайте ткани 100 микролитрами комплекса авидина биотина ABC комнатной температуры.

Через 45 минут срезы два раза промыть в PBS и инкубировать ткани в растворе пероксидазного субстрата до тех пор, пока окрашивание не достигнет соответствующего уровня интенсивности. Теперь промойте срезы в течение пяти минут дистиллированной водой и контрокрашивайте клетки гематоксилином в течение 10 минут при комнатной температуре. После встречного окрашивания снова промойте салфетки в воде.

Затем обезвожьте срезы и с помощью безводного монтажного агента закрепите образцы с покровными стеклами. Затем срезы можно оценить под микроскопом с ярким полем. Начните с отделения кожи взрослого самца мыши от верхней части ноги, поясницы и бока прикалывайте кожу по мере ее удаления.

Затем заберут заднюю подкожную жировую ткань, окружающую паховые лимфатические узлы, расположенные у основания задних ног, для посева адипоцитов. Для анализа адипогенной дифференцировки поместите культуру дифференцированных жировых клеток под вытяжной шкаф и аккуратно промойте клетки PBS. Далее зафиксируйте клетки в двух мл 10%-ного формалина на 60 минут.

По окончании фиксации клетки промыть в воде и обработать культуру двумя миллилитрами 60%-ного изопропанола в течение пяти минут с последующим вводом двух миллилитров масла красного О рабочего раствора. Через пять минут промойте клетки водой из-под крана, пока вода не станет прозрачной. И противопоставить клетки гематоксилину, как только что продемонстрировано.

Затем клетки могут быть оценены под фазово-контрастным микроскопом при 100-кратном увеличении. Липиды адипоцитов будут казаться красными, а ядра – синими. Здесь показаны срезы жировой подушки от нормальных и диетических мышей с высоким содержанием жиров.

Количественная оценка размера и площади адипоцитов ясно демонстрирует гипертрофию адипоцитов после шести недель диеты с высоким содержанием жиров, о чем свидетельствует увеличение размера адипоцитов у животных, получавших диету с высоким содержанием жиров. У мышей, получавших лечение гипоксическим маркером пимонидазолом, повышенный гипоксический статус жировой ткани сопровождался увеличением HIF1 альфа-положительных адипоцитов. Кроме того, туннельное окрашивание жировых срезов у нокаутных и контрольных однопометников демонстрирует, что увеличение апоптоза апоптоза адипоцитов коррелирует с наличием гипоксии и экспрессией гипоксического индуцируемого фактора 1 альфа.

Как и ожидалось, экспрессия Hif1a в адипоцитах увеличивается после 24 часов гипоксии. Более того, количественная оценка генов-мишеней Hif с помощью QPCR указывает на то, что повышенная экспрессия Hif1a в условиях гипоксии приводит к увеличению экспрессии мРНК Inos. Однако сайленсинг Hif1 или 2 альфа с помощью РНК-интерференции спасает адипоциты от апоптоза в условиях гипоксии, подтверждая сенсорную регуляторную роль Hif альфа в апоптозе адипоцитов.

После этих процедур могут быть проведены все анализы, такие как определение глюкозы и резистентности к инсулину, чтобы ответить на дополнительные вопросы о метаболических изменениях и дисфункции адипоцитов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить гистологический анализ исследований апоптоза апоптоза адипоцитов и гипоксии.