Микрожидкостных Flow Камеры Использование водостойких крови к модели гемостаза и тромбоцитарный Переливание In Vitro
19 марта 2016 г.
Трансфузия тромбоцитов и гемостаз были смоделированы с использованием камер восстановления крови и микрофлюидного потока для исследования функции тромбоцитов, хранящих кровь. Полученные данные демонстрируют влияние повреждения накопителей тромбоцитов на гемостаз in vitro.
Общая цель этого эксперимента состоит в том, чтобы имитировать переливание тромбоцитов in vitro и протестировать его с использованием гемостаза на коллагене, с гидродинамическим потоком и микроскопией в реальном времени. Пациенты с тромбоцитопенией лечатся хранящимися концентратами тромбоцитов. Наш метод призван помочь ответить на ключевые вопросы в области тромбоза и гемостаза, уделяя особое внимание качеству и функции таких хранящихся концентратов тромбоцитов.
Дополнительная ценность этого метода заключается в том, что он имитирует кровоток и, таким образом, учитывает реологические влияния на участвующие клетки и биомолекулы. Текущий метод оценивает связывание тромбоцитов с коллагеном. Однако его также можно наносить на другие адгезивные ткани, включая атеросклеротическую бляшку, эндотелиальные клетки или специфические матричные белки, такие как фактор фон Виллебранда и фибриноген.
Начните с подготовки биочипа. Вортекс и разведите коллагеновый запас один к 20 в изотоническом растворе глюкозы производителя до конечной концентрации 50 микрограмм на миллилитр. Затем пипеткой впрыскиваем 0,8 микролитра в дорожки нового одноразового биочипа.
Заполните все полосы на одном конце фишки и отметьте это как выходной конец. Затем осмотрите чип, чтобы убедиться, что каждая дорожка на 5/6 заполнена раствором, и нет пузырьков воздуха. Затем инкубируйте чип при температуре четыре градуса Цельсия в течение четырех часов или на ночь в увлажненном и закрытом контейнере.
Позже заблокируйте кодированные каналы путем пипетирования блокирующего буфера на другом конце полосы. Затем для каждой дорожки отрежьте 12-сантиметровые трубки и прикрепите штифт к каждой длине трубки, чтобы их можно было прикрепить к биочипу. Промойте длину трубки дистиллированной водой из шприца и соединителем.
Затем насытите их блокирующим буфером и запечатайте во влажном контейнере не менее чем на один час. Далее подготавливаем насос и коллектор. Сначала промойте насос и коллектор дистиллированной водой, чтобы удалить пузырьки воздуха.
Далее прикрепите биочип к столику автоматизированного микроскопа. Поместите один конец отрезков в 1,5-миллилитровую трубку, наполненную HBS, затем прикрепите их другим концом к входным отверстиям биочипа. Вставьте штифты коллектора в выходы биочипа.
Затем промойте систему с помощью HBS с помощью насоса. Таким образом, любой оставшийся блокирующий буфер или плохо адгезивный коллаген будет удален. На этом подготовка проточной камеры завершена.
Начните с объединения недавно собранной крови здоровых добровольцев в коническую центрифужную пробирку. Вращайте образец около 15 минут при 250 Gs.Do не используйте тормоз, потому что это нарушит неплотно упакованную нижнюю фазу. Удалите и выбросьте обогащенную тромбоцитами плазму и охристую шерсть.
Сохраните упакованные эритроциты, содержащие как можно меньше тромбоцитов, чтобы образовалась восстановленная кровь. Теперь начните размораживать четыре миллилитра плазмы типа АВ при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут и 20 секунд. Между тем, определяют гематокрит приготовленных упакованных эритроцитов с помощью автоматизированного гематологического анализатора.
Затем определяют концентрацию тромбоцитов в банке крови и готовят концентрат тромбоцитов для использования для восстановления цельной крови. Рассчитайте необходимые объемы для одного миллилитра восстановленной крови с 40% гематокрита и 250 000 тромбоцитов на микролитр. Теперь с помощью обрезанного наконечника пипетки перенесите необходимый объем эритроцитов, плазмы и концентрата тромбоцитов в нужную концентрацию, а конечный объем составит один миллилитр.
Смешайте восстановленную кровь с помощью мягких инверсий и проведите общий анализ крови. Затем возьмите подготовленную микроцентрифужную пробирку, содержащую кальцеин AM, и добавьте в нее один миллилитр восстановленной крови. Смешайте кровь с красителем, используя мягкие инверсии.
Затем инкубируйте восстановленную кровь в течение пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия. В программном обеспечении выберите интересующую область на полосе перфузии. Сосредоточьтесь на коллагеновых волокнах, прикрепленных к нижней части дорожек при 100-кратном увеличении.
В идеале следует использовать фазовый контраст или дифференциальный интерференционный контраст. Выберите параметр «Установить текущую Z» для выбранных областей мозаики, чтобы зафиксировать выбранные положения по оси Z в цифровом виде. Оптический фокус перед перфузией должен быть на коллагене амелобласта, но это может быть непросто.
Альтернативой является установка фокуса микроскопа на исходные адгезивные тромбоциты. Теперь аккуратно перемешайте образцы и расположите их рядом с биочипом. Затем вставьте трубку, соединенную с наблюдаемой дорожкой, в восстановленную кровь.
Затем, используя программное обеспечение, управляющее насосом, примените давление 50 дин на квадратный сантиметр, чтобы переместить образец крови на дорожку и начать эксперимент. Во время эксперимента записывайте изображения каждые 15 секунд в течение пяти минут. Определите кинетику роста тромба с помощью программного обеспечения для анализа изображений.
В данном случае используется Zen 2012. Начните с открытия плагина анализа изображений, чтобы определить покрытие поверхности тромбоцитов. Установите порог флуоресценции на интерактивной вкладке анализа, чтобы определить интенсивность пикселей, которая коррелирует с положительным сигналом, который будет исходить от прилипших тромбоцитов.
Затем используйте Create tables для автоматического создания электронной таблицы со списком поверхностей положительных сигналов для каждой временной точки. Сохраните эти таблицы в формате XML и откройте их в программе для работы с электронными таблицами для дальнейших расчетов. В каждый момент времени вычисляйте общую площадь поверхности выбранных объектов и выражайте это значение в виде процента покрытой поверхности.
Затем построите график данных в зависимости от времени перфузии и рассчитайте наклон с помощью линейной регрессии. Это моделирует кинетику роста тромба в этом конкретном экспериментальном состоянии. Три идентичных восстановленных образца цельной крови были одновременно перфузированы на поверхностях, покрытых коллагеном.
В результате коэффициент вариации составил 8,7%, что позволяет предположить приемлемую внутрипробную и внутрилабораторную вариацию для сравнения тестов. Переливание было смоделировано путем восстановления крови с дефицитным компонентом. Было выполнено несколько реконструкций с уменьшением концентрации тромбоцитов.
Как и ожидалось, более низкое количество тромбоцитов привело к меньшей адгезии в зависимости от времени перфузии. Далее исследовали влияние снижения температуры после забора крови и во время перфузии. Было обнаружено, что тромбы нарастают медленнее, когда кровь охлаждается до комнатной температуры.
По сравнению с образцом, который держался при температуре 37 градусов Цельсия на протяжении всего исследования. Циркулируя в организме, тромбоциты связываются с местами повреждения сосудов в условиях повышенного отвесного напряжения стенки. Как и ожидалось, изменение скорости в микрофлюидных проточных камерах изменяло общую адгезию тромбоцитов.
Эти условия также изменяют кинетику роста тромбов. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как проводить эксперименты в микрофлюидной проточной камере с использованием восстановленной крови для проверки качества и функции хранящихся концентратов тромбоцитов. Эту технику можно выполнить примерно за семь часов.
Эксперименты с микрофлюидной проточной камерой проложили путь исследователям в области переливания тромбоцитов к изучению влияния переменных донорства, подготовки и хранения. Одним из актуальных примеров является инактивация патогенов. Мы привели пример только с одним подопытным.
Тем не менее, вариации концентрации кальция, чистого напряжения и поверхностных покрытий могут быть использованы для решения различных исследовательских вопросов. Аналогично этой процедуре могут быть выполнены другие измерения в микрофлюидных проточных камерах, чтобы ответить на дополнительные вопросы. Например, производительность хранящихся тромбоцитов к свертыванию на потоке.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании изучаются трансфузия тромбоцитов и гемостаз с использованием реконституции крови и микрофлюидных проточных камер. Особое внимание уделяется влиянию повреждений тромбоцитов при хранении на гемостатическую функцию in vitro.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Гематология
- Тромбоз
- Гемостаз
Теоретические сведения
- Пациенты с тромбоцитопенией получают консервированные тромбоцитарные концентраты.
- Повреждения, возникающие при хранении тромбоцитов, могут влиять на гемостатическую функцию.
- Понимание функций тромбоцитов имеет решающее значение для улучшения результатов трансфузии.
- Современные методы позволяют оценить взаимодействие тромбоцитов с коллагеном и другими адгезивными тканями.
Цель исследования
- Для имитации трансфузии тромбоцитов in vitro.
- Для оценки гемостатической функции на коллагене в условиях гидродинамического потока.
- Для исследования качества и функциональности хранимых тромбоцитарных концентратов.
Используемые методы
- Методы реконституции крови.
- Микрофлюидные проточные камеры для микроскопии в режиме реального времени.
- Оценка связывания тромбоцитов с коллагеном.
- Применение к другим адгезивным тканям, таким как атеросклеротическая бляшка.
Основные результаты
- Продемонстрировано влияние повреждений при хранении на функцию тромбоцитов.
- Получены данные о гемостатических способностях хранящихся тромбоцитов.
- Показана значимость гидродинамического потока при оценке взаимодействий тромбоцитов.
- Освещены возможности применения метода для различных типов адгезивных тканей.
Выводы
- В исследовании предлагается новый метод оценки эффективности трансфузии тромбоцитов.
- Результаты могут быть использованы в клинической практике при хранении и трансфузии тромбоцитов.
- Будущие исследования могут расширить понимание последствий для тромбоза и гемостаза.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Данный протокол позволяет командам по биофармацевтическим исследованиям и разработкам оценивать эффективность трансфузии тромбоцитов в физиологически релевантных условиях потока, восполняя критический пробел в доклинической оценке качества препаратов крови. Путем симуляции гемостаза в микрофлюидных камерах с использованием реконструированной крови данный метод обеспечивает количественные показатели функции тромбоцитов в режиме реального времени, что помогает в принятии решений о целесообразности дальнейшей разработки в области трансфузиологии. Этот подход снижает риски при трансляционном переходе, связывая переменные условий хранения с функциональными результатами, тем самым повышая прогностическую достоверность эффективности тромбоцитарных препаратов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверить терапевтические гипотезы относительно функции тромбоцитов и влияния повреждений при хранении на гемостаз.
- Операционная ценность: Обеспечивает функциональную валидацию мишеней для концентратов тромбоцитов в условиях контролируемого напряжения сдвига и температуры.
- Прогностическая ценность: Способствует приоритизации портфеля исследований путем установления корреляции между концентрацией тромбоцитов, длительностью хранения и температурными циклами с кинетикой роста тромба.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Подготовка валидированных биологических систем для последующего скрининга соединений, модулирующих функции тромбоцитов, или методов хранения.
- Воспроизводимость: Получение количественных показателей покрытия поверхности с низкой вариабельностью внутри анализа (CV 8,7%), что обеспечивает надежную оценку соединений.
- Масштабируемость: Поддержка мультиплексного тестирования трех идентичных образцов реконструированной крови одновременно на поверхностях, покрытых коллагеном.
Трансляционные и доклинические исследования
- Клиническая значимость: Моделирование сценариев лечения тромбоцитопении с использованием реконструированной крови для имитации клинического переливания тромбоцитов.
- Трансляционная преемственность: Связь между этапами открытия и доклинической валидации путем измерения гемостатической функции на коллагене в условиях гидродинамического потока.
- Принятие решений с учетом рисков: Обоснование решений о дальнейшем продвижении исследования путем количественной оценки влияния донации крови, транспортировки, разделения компонентов, хранения и инактивации патогенов на функцию тромбоцитов.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в континуум исследований — от ранней валидации мишени до доклинической оценки, что позволяет осуществлять непрерывный контроль качества тромбоцитарных продуктов на всех этапах технологической цепочки.
- Фундаментальная биология: позволяет проверять гипотезы о повреждениях тромбоцитов при хранении и уточнять механизмы гемостаза в условиях потока.
- Скрининг: обеспечивает создание готовых к анализу воспроизводимых систем для оценки адгезии тромбоцитов и кинетики роста тромба.
- Аналитика: позволяет получать количественные данные о кинетике роста тромба с помощью анализа изображений и линейной регрессии, что делает возможным сравнение различных условий.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преемственность с доклиническими исследованиями за счет имитации трансфузии и измерения функциональных результатов в условиях сдвига, имеющих значение при конкретных заболеваниях.
- Повторное использование в масштабах предприятия: создает воспроизводимую возможность оценки качества тромбоцитарных продуктов с учетом множества переменных хранения и этапов обработки.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: обеспечивает прогностическую достоверность оценки функции тромбоцитов за счет снижения механистической неоднозначности эффектов повреждений при хранении.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость благодаря контролируемым протоколам перфузии, блокировки и визуализации.
- Стратегическая ценность: улучшает принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки («go/no-go») путем установления связи между длительностью хранения, температурой и скоростью сдвига с функциональными результатами тромбоцитов.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритизацию оптимизации обработки тромбоцитов с учетом рисков на основе эмпирических данных о гемостазе.
Особенности реализации
- Требуются навыки работы с микрофлюидными устройствами, реконституции крови и микроскопии в режиме реального времени.
- Работа зависит от наличия автоматизированного предметного столика микроскопа, системы насос-манифольд и биосовместимых биочипов.
- Необходима межгрупповая стандартизация показателей гематокрита, концентрации тромбоцитов и настроек давления перфузии.
- Требуется учет адаптации к различным скоростям сдвига, температурным профилям и поверхностным покрытиям (например, коллаген, VWF, фибриноген).
- Практические ограничения включают необходимость заполнения каналов без образования пузырьков воздуха и точного поддержания Z-фокуса во время перфузии.
