Микрожидкостных Flow Камеры Использование водостойких крови к модели гемостаза и тромбоцитарный Переливание

Общая цель данного эксперимента заключается в том, чтобы имитировать трансфузию тромбоцитов in vitro и протестировать её с помощью анализа гемостаза на коллагене с использованием гидродинамического потока и микроскопии в реальном времени. Пациентам с тромбоцитопенией назначают лечение с применением концентрированных препаратов тромбоцитов из банка крови. Наш метод призван помочь в поиске ответов на ключевые вопросы в области тромбоза и гемостаза, с особым акцентом на качестве и функции таких хранящихся концентратов тромбоцитов.

Преимущество данной методики заключается в том, что она имитирует кровоток и, таким образом, учитывает влияние реологии на участвующие клетки и биомолекулы. Текущий метод позволяет оценить связывание тромбоцитов с коллагеном. Однако его также можно применять к другим адгезивным тканям, включая атеросклеротические бляшки, эндотелиальные клетки или специфические матриксные белки, такие как фактор фон Виллебранда и фибриноген.

Начните с подготовки биочипа. Перемешайте на вортексе и разведите стоковый раствор коллагена в изотоническом растворе глюкозы от производителя в соотношении 1:20 до конечной концентрации 50 µg/mL. Затем внесите по 0,8 µL в каналы нового одноразового биочипа.

Заполните все каналы с одного конца чипа и отметьте этот конец как выходной. Затем осмотрите чип, чтобы убедиться, что каждый канал заполнен раствором на 5/6 и в нем нет пузырьков воздуха. После этого инкубируйте чип при 4 °C в течение четырех часов или в течение ночи в закрытом увлажненном контейнере.

Затем заблокируйте кодированные каналы, внеся блокирующий буфер в противоположный конец дорожек. После этого для каждой дорожки отрежьте отрезки трубок длиной 12 см и прикрепите к каждому отрезку штифт, чтобы их можно было присоединить к биочипу. Промойте отрезки трубок дистиллированной водой с помощью шприца и соединителя.

Затем насытите их блокирующим буфером и поместите в увлажненный контейнер минимум на один час. После этого подготовьте насос и манифольд. Сначала промойте насос и манифольд дистиллированной водой, чтобы удалить пузырьки воздуха.

Затем закрепите биочип на предметном столике автоматического микроскопа. Поместите один конец трубок в пробирку объемом 1.5 мл, заполненную HBS, затем подсоедините их другим концом к входным отверстиям биочипа. Вставьте штифты коллектора в выходные отверстия биочипа.

Затем промойте систему HBS с помощью насоса. Таким образом будут удалены остатки блокирующего буфера или плохо прикрепившийся коллаген. На этом подготовка проточной камеры завершена.

Начните с объединения образцов крови, недавно взятых у здоровых добровольцев, в коническую центрифужную пробирку. Центрифугируйте образец в течение примерно 15 минут при 250 Gs. Не используйте торможение, так как это может нарушить структуру рыхло упакованной нижней фазы. Удалите и утилизируйте плазму, обогащенную тромбоцитами, и лейкоцитарный слой.

Сохраните взвесь эритроцитов с минимально возможным содержанием тромбоцитов для последующего приготовления реконструированной крови. Теперь начните размораживание 4 mL плазмы группы AB при 37 °C в течение 5 минут и 20 секунд. Тем временем определите гематокрит подготовленной взвеси эритроцитов с помощью автоматического гематологического анализатора.

Затем определите концентрацию тромбоцитов в приготовленном банком крови тромбоцитарном концентрате, который будет использоваться для реконституции цельной крови. Рассчитайте объемы, необходимые для получения одного миллилитра реконструированной крови с гематокритом 40% и содержанием тромбоцитов 250 000 на микролитр. Теперь, используя обрезанный наконечник пипетки, перенесите необходимый объем эритроцитов, плазмы и тромбоцитарного концентрата до достижения требуемой концентрации и конечного объема один миллилитр.

Перемешайте реконструированную кровь осторожными инверсиями и проведите общий анализ крови. Затем возьмите подготовленную микроцентрифужную пробирку с Calcein AM и добавьте в нее 1 mL реконструированной крови. Перемешайте кровь с красителем осторожными инверсиями.

Затем инкубируйте реконструированную кровь в течение пяти минут при 37 °C. В программном обеспечении выберите область интереса в канале перфузии. Сфокусируйтесь на коллагеновых волокнах, прикрепившихся к дну каналов, при 100-кратном увеличении.

В идеале следует использовать фазово-контрастную или дифференциально-интерференционную контрастную микроскопию. Выберите опцию «set current Z for selected tile regions» (установить текущее значение Z для выбранных областей плитки) для цифровой фиксации выбранных позиций по оси Z. Перед началом перфузии оптический фокус должен быть настроен на коллаген амелобластов, однако добиться этого может быть сложно.

В качестве альтернативы можно настроить фокус микроскопа на первоначально прикрепившиеся тромбоциты. Теперь осторожно перемешайте образцы и расположите их рядом с биочипом. Затем поместите трубку, подключенную к наблюдаемому каналу, в реконструированную кровь.

Затем с помощью программного обеспечения, управляющего насосом, приложите давление 50 dyne/cm², чтобы переместить образец крови в канал, и начните эксперимент. В ходе эксперимента регистрируйте изображения каждые 15 секунд в течение пяти минут. Определите кинетику роста тромба с помощью программного обеспечения для анализа изображений.

В данном случае используется ПО Zen 2012. Начните с открытия плагина анализа изображений для определения степени покрытия поверхности тромбоцитами. В интерактивной вкладке анализа установите порог флуоресценции, чтобы определить интенсивность пикселей, соответствующую положительному сигналу, который исходит от адгезированных тромбоцитов.

Затем используйте функцию создания таблиц для автоматической генерации электронной таблицы со списком площадей поверхности положительных сигналов для каждого момента времени. Сохраните эти таблицы в формате XML и откройте их в программе для работы с электронными таблицами для проведения дальнейших расчетов. Для каждого момента времени вычислите суммарную площадь поверхности выбранных объектов и выразите это значение в виде процента покрытой поверхности.

Затем постройте график зависимости данных от времени перфузии и рассчитайте наклон прямой с помощью линейной регрессии. Это позволит смоделировать кинетику роста тромба для данного конкретного экспериментального условия. Три идентичных образца реконструированной цельной крови перфузировали одновременно через поверхности, покрытые коллагеном.

Это привело к коэффициенту вариации 8.7%, что указывает на приемлемую внутрисерийную и внутрилабораторную вариабельность для сравнения тестов. Трансфузия была смоделирована путем восстановления крови с использованием дефицитного компонента. Было выполнено несколько восстановлений с постепенно снижающимися концентрациями тромбоцитов.

Как и ожидалось, более низкое количество тромбоцитов привело к снижению адгезии в зависимости от времени перфузии. Далее были исследованы эффекты понижения температуры после забора крови и во время перфузии. Было обнаружено, что тромбы образуются медленнее, если кровь охлаждали до комнатной температуры.

По сравнению с образцом, который в течение всего исследования содержался при 37 °C. При циркуляции тромбоциты связываются с местами повреждения сосудов в условиях повышенного напряжения сдвига на стенке. Как и ожидалось, изменение скорости сдвига в микрофлюидных камерах привело к изменению общего уровня адгезии тромбоцитов.

Эти условия также изменяют кинетику роста тромба. После просмотра данного видео зритель должен получить четкое представление о том, как проводить эксперименты в микрофлюидной камере с использованием реконструированной крови для проверки качества и функции хранимых концентратов тромбоцитов. Выполнение данной методики занимает примерно семь часов.

Эксперименты с использованием микрофлюидных проточных камер открыли исследователям в области трансфузии тромбоцитов возможность изучить влияние переменных, связанных с донацией, подготовкой и хранением. Одним из актуальных примеров является инактивация патогенов. Мы привели пример только одного экспериментального объекта.

Тем не менее, варьирование концентрации кальция, напряжения сдвига и типов поверхностных покрытий может быть использовано для решения различных исследовательских задач. Аналогично данной процедуре, в микрофлюидных проточных камерах могут быть проведены другие измерения для получения дополнительных данных. Например, можно оценить свертывающую способность хранившихся тромбоцитов в условиях потока.