Микрожидкостных Flow Камеры Использование водостойких крови к модели гемостаза и тромбоцитарный Переливание In Vitro

Общая цель этого эксперимента состоит в том, чтобы имитировать переливание тромбоцитов in vitro и протестировать его с использованием гемостаза на коллагене, с гидродинамическим потоком и микроскопией в реальном времени. Пациенты с тромбоцитопенией лечатся хранящимися концентратами тромбоцитов. Наш метод призван помочь ответить на ключевые вопросы в области тромбоза и гемостаза, уделяя особое внимание качеству и функции таких хранящихся концентратов тромбоцитов.

Дополнительная ценность этого метода заключается в том, что он имитирует кровоток и, таким образом, учитывает реологические влияния на участвующие клетки и биомолекулы. Текущий метод оценивает связывание тромбоцитов с коллагеном. Однако его также можно наносить на другие адгезивные ткани, включая атеросклеротическую бляшку, эндотелиальные клетки или специфические матричные белки, такие как фактор фон Виллебранда и фибриноген.

Начните с подготовки биочипа. Вортекс и разведите коллагеновый запас один к 20 в изотоническом растворе глюкозы производителя до конечной концентрации 50 микрограмм на миллилитр. Затем пипеткой впрыскиваем 0,8 микролитра в дорожки нового одноразового биочипа.

Заполните все полосы на одном конце фишки и отметьте это как выходной конец. Затем осмотрите чип, чтобы убедиться, что каждая дорожка на 5/6 заполнена раствором, и нет пузырьков воздуха. Затем инкубируйте чип при температуре четыре градуса Цельсия в течение четырех часов или на ночь в увлажненном и закрытом контейнере.

Позже заблокируйте кодированные каналы путем пипетирования блокирующего буфера на другом конце полосы. Затем для каждой дорожки отрежьте 12-сантиметровые трубки и прикрепите штифт к каждой длине трубки, чтобы их можно было прикрепить к биочипу. Промойте длину трубки дистиллированной водой из шприца и соединителем.

Затем насытите их блокирующим буфером и запечатайте во влажном контейнере не менее чем на один час. Далее подготавливаем насос и коллектор. Сначала промойте насос и коллектор дистиллированной водой, чтобы удалить пузырьки воздуха.

Далее прикрепите биочип к столику автоматизированного микроскопа. Поместите один конец отрезков в 1,5-миллилитровую трубку, наполненную HBS, затем прикрепите их другим концом к входным отверстиям биочипа. Вставьте штифты коллектора в выходы биочипа.

Затем промойте систему с помощью HBS с помощью насоса. Таким образом, любой оставшийся блокирующий буфер или плохо адгезивный коллаген будет удален. На этом подготовка проточной камеры завершена.

Начните с объединения недавно собранной крови здоровых добровольцев в коническую центрифужную пробирку. Вращайте образец около 15 минут при 250 Gs.Do не используйте тормоз, потому что это нарушит неплотно упакованную нижнюю фазу. Удалите и выбросьте обогащенную тромбоцитами плазму и охристую шерсть.

Сохраните упакованные эритроциты, содержащие как можно меньше тромбоцитов, чтобы образовалась восстановленная кровь. Теперь начните размораживать четыре миллилитра плазмы типа АВ при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут и 20 секунд. Между тем, определяют гематокрит приготовленных упакованных эритроцитов с помощью автоматизированного гематологического анализатора.

Затем определяют концентрацию тромбоцитов в банке крови и готовят концентрат тромбоцитов для использования для восстановления цельной крови. Рассчитайте необходимые объемы для одного миллилитра восстановленной крови с 40% гематокрита и 250 000 тромбоцитов на микролитр. Теперь с помощью обрезанного наконечника пипетки перенесите необходимый объем эритроцитов, плазмы и концентрата тромбоцитов в нужную концентрацию, а конечный объем составит один миллилитр.

Смешайте восстановленную кровь с помощью мягких инверсий и проведите общий анализ крови. Затем возьмите подготовленную микроцентрифужную пробирку, содержащую кальцеин AM, и добавьте в нее один миллилитр восстановленной крови. Смешайте кровь с красителем, используя мягкие инверсии.

Затем инкубируйте восстановленную кровь в течение пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия. В программном обеспечении выберите интересующую область на полосе перфузии. Сосредоточьтесь на коллагеновых волокнах, прикрепленных к нижней части дорожек при 100-кратном увеличении.

В идеале следует использовать фазовый контраст или дифференциальный интерференционный контраст. Выберите параметр «Установить текущую Z» для выбранных областей мозаики, чтобы зафиксировать выбранные положения по оси Z в цифровом виде. Оптический фокус перед перфузией должен быть на коллагене амелобласта, но это может быть непросто.

Альтернативой является установка фокуса микроскопа на исходные адгезивные тромбоциты. Теперь аккуратно перемешайте образцы и расположите их рядом с биочипом. Затем вставьте трубку, соединенную с наблюдаемой дорожкой, в восстановленную кровь.

Затем, используя программное обеспечение, управляющее насосом, примените давление 50 дин на квадратный сантиметр, чтобы переместить образец крови на дорожку и начать эксперимент. Во время эксперимента записывайте изображения каждые 15 секунд в течение пяти минут. Определите кинетику роста тромба с помощью программного обеспечения для анализа изображений.

В данном случае используется Zen 2012. Начните с открытия плагина анализа изображений, чтобы определить покрытие поверхности тромбоцитов. Установите порог флуоресценции на интерактивной вкладке анализа, чтобы определить интенсивность пикселей, которая коррелирует с положительным сигналом, который будет исходить от прилипших тромбоцитов.

Затем используйте Create tables для автоматического создания электронной таблицы со списком поверхностей положительных сигналов для каждой временной точки. Сохраните эти таблицы в формате XML и откройте их в программе для работы с электронными таблицами для дальнейших расчетов. В каждый момент времени вычисляйте общую площадь поверхности выбранных объектов и выражайте это значение в виде процента покрытой поверхности.

Затем построите график данных в зависимости от времени перфузии и рассчитайте наклон с помощью линейной регрессии. Это моделирует кинетику роста тромба в этом конкретном экспериментальном состоянии. Три идентичных восстановленных образца цельной крови были одновременно перфузированы на поверхностях, покрытых коллагеном.

В результате коэффициент вариации составил 8,7%, что позволяет предположить приемлемую внутрипробную и внутрилабораторную вариацию для сравнения тестов. Переливание было смоделировано путем восстановления крови с дефицитным компонентом. Было выполнено несколько реконструкций с уменьшением концентрации тромбоцитов.

Как и ожидалось, более низкое количество тромбоцитов привело к меньшей адгезии в зависимости от времени перфузии. Далее исследовали влияние снижения температуры после забора крови и во время перфузии. Было обнаружено, что тромбы нарастают медленнее, когда кровь охлаждается до комнатной температуры.

По сравнению с образцом, который держался при температуре 37 градусов Цельсия на протяжении всего исследования. Циркулируя в организме, тромбоциты связываются с местами повреждения сосудов в условиях повышенного отвесного напряжения стенки. Как и ожидалось, изменение скорости в микрофлюидных проточных камерах изменяло общую адгезию тромбоцитов.

Эти условия также изменяют кинетику роста тромбов. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как проводить эксперименты в микрофлюидной проточной камере с использованием восстановленной крови для проверки качества и функции хранящихся концентратов тромбоцитов. Эту технику можно выполнить примерно за семь часов.

Эксперименты с микрофлюидной проточной камерой проложили путь исследователям в области переливания тромбоцитов к изучению влияния переменных донорства, подготовки и хранения. Одним из актуальных примеров является инактивация патогенов. Мы привели пример только с одним подопытным.

Тем не менее, вариации концентрации кальция, чистого напряжения и поверхностных покрытий могут быть использованы для решения различных исследовательских вопросов. Аналогично этой процедуре могут быть выполнены другие измерения в микрофлюидных проточных камерах, чтобы ответить на дополнительные вопросы. Например, производительность хранящихся тромбоцитов к свертыванию на потоке.