Видео с изображениями и Пространственно-временные Карты для анализа моторику желудочно у мышей

Общая цель данной методики заключается в выявлении изменений в нейронной регуляции моторики толстой кишки у мышей с помощью видеовизуализации. Эта техника позволяет ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии кишечника, например, влияют ли незначительные генетические мутации в нейрональных генах на моторику толстой кишки. Основным преимуществом данного метода является то, что ткань представляет собой изолированную систему в отсутствие влияния центральной нервной системы, и, как следствие, данный метод позволяет исследовать роль энтеральной нервной системы в контроле моторики желудочно-кишечного тракта.

Данная методика применима для терапии нейроонтогенетических заболеваний, таких как аутизм, поскольку генные мутации, изменяющие синаптическую функцию в мозге, могут также влиять на моторику кишечника. Начните с использования диссекционных пинцетов и ножниц, чтобы сделать разрез эпидермиса над нижними слоями мышц брюшной стенки. Раскройте брюшную полость по срединной линии до грудины.

Увлажните ткань физиологическим раствором и с помощью пинцета осторожно приподнимите слепую кишку на четыре-пять сантиметров над брюшной полостью. Затем, используя ножницы для тонкого препарирования, подрежьте брыжейку, стараясь не затрагивать, не растягивать и не повреждать ткани желудочно-кишечного тракта. Удалите мочевой пузырь, семенники и любые другие излишки тканей.

Затем, используя грубые диссекционные ножницы, сделайте два вертикальных разреза примерно в 0,5 сантиметра от средней линии в тазовой кости с каждой стороны от ободочной кишки, и с помощью тонких ножниц отделите прямую кишку от прилегающих тканей таза. Удалите брыжейку из ободочной кишки и промойте ткань ободочной кишки всей ее длины в стакане с физиологическим раствором. Чтобы удалить фекальные пеллеты и другое содержимое кишечника, сначала обрежьте примерно один сантиметр с конца наконечника 200-микролитрового дозатора и прикрепите его к пятимиллилитровому шприцу, заполненному физиологическим раствором.

Затем, после удаления слепой и прямой кишки, вставьте энтомологическую булавку в самый проксимальный конец ободочной кишки в месте, где видны складки слизистой оболочки, чтобы ориентировать ткань. Теперь осторожно захватите ткань за проксимальный конец, введите наконечник пипетки в просвет и промойте ободочную кишку физиологическим раствором, сливая его в контейнер для отходов. Далее, используя тот же шприц и наконечник пипетки, промойте свежим физиологическим раствором любые остатки из трубок, подключенных к двухкамерной органной ванне.

Установите органную ванну таким образом, чтобы камеры непрерывно промывались физиологическим раствором, насыщенным карбогеном; используйте температурный датчик для регулярного контроля температуры раствора в диапазоне от 33 до 37 °C. Для поддержания давления в приемном резервуаре используйте резиновую пробку со стеклянной трубкой внутренним диаметром 5 мм, вставленной в центре. Затем полностью погрузите участок толстой кишки длиной 5–7 см в камеру органной ванны, после чего с помощью пинцета и стандартной хлопчатобумажной портновской нити зафиксируйте проксимальный конец кишки к входной трубке, а дистальный конец — к выходной трубке.

После определения исходного расстояния между проксимальной и дистальной канюляцией ободочной кишки выдержите ткань в физиологическом растворе в течение 30 минут для уравновешивания. Для записи кишечных движений, пока происходит акклиматизация ободочной кишки, установите видеокамеру на стандартном лабораторном штативе на высоте 10–15 сантиметров над органной ванной и настройте соответствующее программное обеспечение для захвата видео. После подготовки камеры запишите четыре 15-минутных видеосегмента работы ободочной кишки в контрольных условиях.

Затем в течение 30–60 минут проводите суперфузию исследуемого препарата в органный резервуар, записывая еще четыре 15-минутных видеосегмента. В завершение замените раствор для обработки свежим физиологическим раствором и запишите еще четыре 15-минутных видеосегмента в течение одного часа периода вымывания. После этого можно построить пространственно-временные карты толстой кишки в ответ на различные периоды обработки.

Чтобы оценить, влияют ли синаптические мутации на колонические мигрирующие моторные комплексы (КММК) при фармакологическом воздействии на энтеральную нервную систему, в данном эксперименте в камеру органного баня с препаратом толстой кишки был добавлен трописетрон — антагонист рецепторов 5-HT3 и 5-HT4. В присутствии трописетрона у мышей линии NL3R451C наблюдалось снижение частоты КММК по сравнению с контрольными мышами дикого типа из того же помета. Хотя при контролируемых условиях значимых различий в сократимости между мышами дикого типа и NL3R451C обнаружено не было, трописетрон существенно снизил частоту КММК как у мышей дикого типа, так и у мышей NL3R451C.

Кроме того, трописетрон оказал более выраженное влияние на частоту CMMC у мышей линии NL3R451C по сравнению с животными дикого типа. После освоения эта методика может быть выполнена за четыре часа при условии правильного проведения. При выполнении данной методики убедитесь, что в органной ванне поддерживается постоянная температура, обеспечен непрерывный подвод карбогена, а перелив физиологического раствора предотвращается с помощью вакуума.

После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, например, иммуноцитохимию, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как: происходят ли изменения в пропорциях нейронов или количестве клеток у мышей с нарушением моторики толстой кишки? Разработка данного метода позволила провести множество исследований моторики кишечника у морских свинок, кроликов, крыс и других видов, и особенно в данном случае — у мышей. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как выявлять изменения в нейронной регуляции моторики толстой кишки с помощью видеовизуализации.