Определение фоторецепторных клеток спектральной чувствительности в насекомых модель от В Vivo Внутриклеточные Записи

Общей целью данного метода внутриклеточной регистрации является определение спектральной чувствительности отдельных фоторецепторных клеток в сложном глазу насекомого in vivo. Этот метод может сказать нам, влияют ли фильтрующие пигменты на длины волн света, к которым чувствительна клетка. Основное преимущество этого метода заключается в том, что, зная спектральную чувствительность отдельных фоторецепторов, мы можем предсказать, какой диапазон цветов может видеть животное.

Чтобы подготовиться к записи, включите ксеноновую лампу не менее чем за 45 минут до эксперимента, а съемник микроэлектродов включите не менее чем за 30 минут до вытягивания стеклянных электродов. Далее включаем всю записывающую аппаратуру. Убедитесь, что жалюзи закрыты по умолчанию, чтобы свет не проходил через оптоволоконный кабель.

Затем вытяните тонкие микроэлектроды из боросиликатного стекла с помощью съемника микроэлектродов. Заполните электроды тремя молярами хлорида калия. Чтобы подготовить образец, под микроскопом поместите отдельную бабочку внутрь небольшой пластиковой трубки с горячим воском, чтобы голова была неподвижной и выступала из одного конца трубки.

Затем прикрепите хоботок, усики и крылья воском. После этого прижмите живот сухим кусочком воска. Поддерживайте влажность трубки, поместив внутрь нее влажную салфетку за брюшной полостью образца.

Убедитесь, что экземпляр полностью неподвижен. Затем установите трубку с помощью небольшого кусочка воска на небольшую платформу с шаровым соединением, которое прикреплено к магнитному основанию. Под препарирующим микроскопом вставьте серебряную проволоку в голову через ротовую часть в качестве электрода сравнения.

Перед экспериментом навсегда закрепите провод на платформе. Затем вырежьте небольшое отверстие в левой роговице с помощью лезвия бритвы и заклейте отверстие вазелином, чтобы предотвратить высыхание. После того, как роговица будет разрезана, как можно быстрее вставьте записывающий электрод в глаз, потому что гемолимфа в глазу быстро затвердеет и сделает невозможным введение электрода.

По возможности выполните вскрытие в буровой установке, где будет происходить запись. Затем подсоедините заземляющий провод головной ступени к электроду сравнения на платформе образца с помощью зажимов типа «крокодил». Установите электрод на держатель электрода.

Впоследствии вставьте серебряную проволоку в раствор хлорида калия в микроэлектроде. Используйте источник света с насадками в виде гусиной шеи, чтобы осветить образец под стереоскопом, опуская электрод в глаз. Отрегулируйте держатель электродов так, чтобы микроэлектрод находился непосредственно над отверстием, ранее вырезанным в роговице.

Затем опустите микроэлектрод в глаз с помощью микроманипулятора, пока контур не будет завершен. Попав в глаз, выведите стереоскоп за пределы клетки Фарадея. Выключите источник света, освещающий экземпляр, и оставьте насекомое в темноте на 10-20 минут для адаптации в темноте.

Проверьте сопротивление электрода, подав ток в один наноампер и отметив изменение напряжения. Сопротивление обычно должно находиться в диапазоне от 100 до 250 мегаом. Затем активируйте генератор импульсов, чтобы обеспечить вспышку света на время эксперимента, и направьте оптоволоконный кабель к глазу.

Проверяйте осциллограф на изменение напряжения с каждой световой вспышкой. Отрицательное изменение напряжения означает, что электрод еще не вошел в ячейку. Перемещайте оптоволоконный кабель вокруг образца до тех пор, пока не будет наблюдаться максимальная реакция напряжения.

Чтобы получить деполяризующий световой отклик, вращайте микроманипулятор вперед и назад, что приводит к небольшим вертикальным перемещениям электрода, при этом слегка постукивая по основанию держателя электрода или используя функцию жужжания на предусилителе. Продолжайте выполнять небольшие регулировки до тех пор, пока на осциллографе не появится реакция деполяризующего света. Затем отрегулируйте оптоволоконный кабель, чтобы найти самый большой деполяризующий сигнал.

Внесите небольшие корректировки с помощью микроманипулятора и при необходимости используйте функцию жужжания на усилителе, чтобы убедиться, что электрод стабильно записывает ячейку. Стабильная запись должна практически не иметь изменений в потенциале покоя, низком фоновом шуме и стабильно большом отклике деполяризации. Очень важно иметь стабильную запись, при которой мембранный потенциал покоя не зашумлен и не изменяется со временем.

Ответы должны быть масштабными и положительными, без гиперполяризации. Как только настройка стабилизируется, откройте программное обеспечение и закройте диалоговое окно под названием «Галерея экспериментов», чтобы открыть всплывающее окно с четырьмя каналами. Отрегулируйте шкалу напряжения в правом верхнем углу окна программного обеспечения на 500 милливольт.

Затем нажмите «Начать» в правом нижнем углу, чтобы начать запись. Сверните третий и четвертый каналы и отрегулируйте шкалу X и Y. Затем дайте программному обеспечению работать в течение всего эксперимента.

Для стимуляции белым светом запишите до 10 отдельных реакций, при этом колесо фильтра ND установлено на самый высокий внешний диаметр, который все еще вызывает отклик. Здесь изменение отклика показано при 3,0 OD и 2,0 OD. Затем запишите одинаковое количество откликов от 3,5 до 0,0 OD в каждой комбинации, чтобы получить логарифмическую кривую интенсивности отклика. Прежде чем записывать отклик ячейки на все длины волн с помощью интерференционных фильтров, сначала быстро найдите пиковую длину волны.

Если на световом тракте нет нейтрального фильтра, поместите туда фильтр, передающий ультрафиолетовое излучение, и кратко понаблюдайте за амплитудой отклика. Повторите ту же процедуру с синим передающим фильтром, зеленым передающим фильтром и красным передающим фильтром, которые должны дать некоторое представление о том, где будет пиковая характеристика. Запись под длину волны фильтра, которая дает максимальный отклик, перед переключением на другой интерференционный фильтр.

Между записью с последующими фильтрами позвольте ячейке реагировать на одну-две вспышки белого света без какого-либо фильтра на световом пути, чтобы помочь отслеживать, ухудшается ли пиковая реакция со временем. Затем запишите с помощью других фильтров помех и предоставьте до 10 откликов на фильтр. Это пример большого изменения отрицательного напряжения, которое наблюдается непосредственно перед входом в ячейку.

Здесь показана чистая запись, которая имеет небольшой фоновый шум и большую деполяризующую характеристику, обычно не менее 40 милливольт. А вот пример плохой записи, из-за изменения отрицательного потенциала после основного пика. Это еще один пример плохой записи.

Потенциал покоя претерпевает большие колебания, и большое количество фонового шума может заслонять амплитуду отклика. Это репрезентативный пример спектральной чувствительности, полученной на основе одной записи. Типы ячеек классифицируются по пиковой чувствительности на одинаковой длине волны и общей форме спектра чувствительности.

Затем те же типы ячеек усредняются, а средняя чувствительность строится на график со стандартными полосами погрешностей на каждой длине волны. На этом графике показана спектральная чувствительность трех типичных типов клеток, обнаруженных у насекомых. После освоения этой техники ее можно сделать примерно за два часа.

После этой процедуры можно провести поведенческие эксперименты, чтобы определить, все ли типы фоторецепторных клеток способствуют различению цветов.