Мульти-целевой Хромогенный Всего монтажа
31 января 2016 г.
Мы опишем весь Mount-гибридизация процедуру мульти-целевой хромогенную (MC-желанию) в интактных эмбрионов дрозофилы, позволяющих одновременно и конкретное обнаружение трех различных моделей распределения мРНК путем контрастных цветовых выделений.
Общая цель хромогенного многоцелевого WISH (гибридизации in situ с использованием зондов) заключается в облегчении картирования паттернов распределения мРНК в неповрежденных эмбрионах Drosophila. С помощью этого метода можно напрямую сравнивать локализацию мРНК трех различных генов внутри одного и того же эмбриона. Многоцветный WISH может быть использован для быстрого и надежного создания карт экспрессии генов в развивающихся организмах. Это может дать важные сведения о регуляторных взаимодействиях генов, активном и эмбриональному развитию или органогенезе. Основным преимуществом данной методики является то, что паттерны экспрессии мРНК разных генов визуализируются в различных контрастных цветах. Таким образом, можно с высокой точностью выделить уникальные и перекрывающиеся сайты экспрессии. Используя стандартные процедуры, соберите, дехорионируйте, зафиксируйте и девителлинизируйте необходимые эмбрионы. Храните их в метаноле в морозильнике до востребования. Теперь начните работу с эмбрионами при комнатной температуре. Поместите вставку в первую лунку планшета на 12 лунок и добавьте 2 mL метанола. Перенесите необходимое количество эмбрионов во вставку, которая будет использоваться для перемещения эмбрионов на протяжении всей процедуры. Теперь регидратируйте эмбрионы, используя трехминутные инкубации в серии убывающего содержания метанола. Начните с 75% метанола в PBS. Затем используйте 50% метанол в PBS-T. После этого используйте 25% метанол в PBS-T и закончите двумя инкубациями в чистом PBS-T. Затем проведите префиксацию эмбрионов в 4% параформальдегиде в PBS в течение 20 минут при комнатной температуре. Удалите фиксатор, используя четыре промывки в PBS-T. Во время этапов промывки разморозьте и подготовьте рабочие растворы протеиназы K и глицина. После промывок пермеабилизируйте эмбрионы в свежеприготовленном растворе протеиназы K в течение трех минут при комнатной температуре. Остановите реакцию, используя две одноминутные промывки в свежеприготовленном растворе глицина. Затем проведите постфиксацию эмбрионов в 4% параформальдегиде в PBS в течение 20 минут при комнатной температуре. Вымойте параформальдегид четырьмя промывками в PBS-T по три минуты каждая. Затем перенесите эмбрионы в буфер для прегибридизации. Их можно хранить в морозильнике до востребования. Начните с распределения эмбрионов в буфере для прегибридизации по пробиркам объемом 2 mL. В каждую пробирку аликвотируйте примерно 15 µL осевших эмбрионов. Теперь инкубируйте эмбрионы при 65
Обзор
В данной статье представлена процедура многоцелевой хромогенной гибридизации in situ по всему эмбриону (MC-WISH) для эмбрионов Drosophila. Этот метод позволяет одновременно выявлять паттерны распределения трех различных мРНК, используя осадки контрастных цветов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология развития
- Анализ экспрессии генов
Теоретические основы
- Картирование паттернов распределения мРНК имеет решающее значение для понимания регуляторных взаимодействий генов.
- Метод MC-WISH позволяет сравнивать экспрессию генов внутри одного и того же эмбриона.
- Данная техника с высокой точностью выявляет уникальные и перекрывающиеся сайты экспрессии.
- Этот метод применим при изучении эмбрионального развития и органогенеза.
Цель исследования
- Для облегчения картирования паттернов распределения мРНК в интактных эмбрионах Drosophila.
- Для обеспечения быстрого и надежного метода создания карт экспрессии генов.
- Для углубления понимания генных взаимодействий в процессе развития.
Используемые методы
- Сбор и фиксация эмбрионов Drosophila.
- Регидратация с использованием серии убывающего содержания метанола.
- Пермеабилизация с помощью протеиназы K.
- Постфиксация и гибридизация в буфере для предгибридизации.
Основные результаты
- Успешная визуализация паттернов экспрессии мРНК в различных цветах.
- Возможность одновременного сравнения экспрессии трех разных генов.
- Высокая точность определения перекрывающихся участков экспрессии.
- Потенциальное применение в изучении механизмов регуляции генов.
Выводы
- MC-WISH является эффективным методом анализа распределения мРНК в эмбрионах.
- Данный метод позволяет получить представление о динамике экспрессии генов в процессе развития.
- Он может стать ценным инструментом для исследователей, изучающих биологию развития.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Мультитаргетная хромогенная гибридизация in situ на целых эмбрионах (MC-WISH) позволяет проводить прямое пространственное сравнение паттернов экспрессии нескольких генов в неповрежденных эмбрионах, что способствует снижению механистических рисков при валидации мишеней за счет уточнения коэкспрессии и регуляторных взаимосвязей. Эта возможность повышает точность прогнозов на ранних этапах поиска, обеспечивая воспроизводимые результаты высокого разрешения по транскрипционной активности в соответствующих заболеванию системах развития. Применимость данного метода к эмбрионам Drosophila и zebrafish делает его масштабируемым инструментом для анализа сигнальных путей и фенотипического скрининга в доклинических модельных системах.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишеней
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем картирования пространственных соотношений между доменами экспрессии генов для выяснения взаимодействий в сигнальных путях.
- Практическая ценность: способствует функциональной валидации мишеней посредством прямой визуализации уникальных и перекрывающихся сайтов мРНК с высокой точностью.
- Прогностическая ценность: улучшает отбор перспективных кандидатов в портфеле препаратов за счет снижения механистической неопределенности в генных регуляторных сетях в процессе эмбрионального развития и органогенеза.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующих этапов анализа путем создания надежных мультиплексных карт экспрессии генов.
- Практическая ценность: Повышение стандартизации и воспроизводимости анализа за счет одновременного детектирования трех видов мРНК с использованием контрастных цветов.
- Масштабируемость: Обеспечение возможности повторного использования платформы и надежной оценки соединений путем получения количественных пространственных данных в интактных образцах.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: связывает результаты открытий с доклинической валидацией за счет сохранения пространственного контекста экспрессии генов на различных стадиях развития.
- Продвижение с учетом рисков: поддерживает принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) путем определения точных сайтов экспрессии, что позволяет согласовать биомаркеры и определить релевантность заболеванию.
- Механистическое снижение рисков: фокусируется на прогностической значимости, позволяя проводить прямое сравнение транскрипционной динамики в системах, релевантных заболеванию.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Метод MC-WISH вписывается в общий процесс поиска лекарственных средств — от проверки гипотез о мишенях до идентификации ведущих соединений, предоставляя пространственно-разрешенные данные о транскрипции, которые способствуют раннему пониманию механизмов и подготовке методов анализа.
- Биология открытий: Способствует проверке гипотез и уточнению путей передачи сигналов, обеспечивая прямое сравнение паттернов распределения мРНК в интактных эмбрионах.
- Скрининг: Обеспечивает готовность к анализу за счет воспроизводимых мультиплексных колориметрических результатов, позволяющих проводить параллельное сравнение экспрессии генов.
- Аналитика: Позволяет получать количественные пространственные измерения посредством хромогенного осаждения, что облегчает сравнение условий и анализ коэкспрессии.
- Трансляционные исследования: Сохраняют контекст развития от этапа открытия до доклинических стадий, поддерживая согласование биомаркеров в моделях органогенеза.
- Корпоративное повторное использование: Функционирует как многократно используемый инструмент в различных проектах благодаря применимости к нескольким модельным системам (Drosophila, zebrafish) и адаптивности к различным панелям генов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую уверенность при валидации мишеней за счет снижения неопределенности в коэкспрессии генов и регуляторных взаимодействиях.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизацию и масштабируемость благодаря стандартизированному хромогенному детектированию и рабочим процессам с эмбрионами, пригодными для хранения в морозильнике.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала, позволяя на ранних этапах снизить риски, связанные с мишенями, посредством высокоточного пространственного картирования.
- Влияние на портфель: Обосновывает приоритизацию с учетом рисков, предоставляя четкие визуальные данные о перекрытии и уникальности экспрессии для принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go).
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области эмбриологии, гибридизации нуклеиновых кислот и методов хромогенной детекции.
- Зависимость от колориметрического оборудования на основе щелочной фосфатазы и стандартной инфраструктуры для молекулярной биологии.
- Необходима межкомандная стандартизация дизайна зондов, маркировки гаптенами и протоколов проявления цвета.
- При переносе метода с эмбрионов Drosophila на эмбрионы zebrafish требуются адаптационные изменения из-за различий в проницаемости и фиксации.
- Практические ограничения включают глубину проникновения зонда в эмбрионы на поздних стадиях развития и возможности мультиплексирования сигналов, ограниченные доступными оттенками хромогенов.
