Развитие Лиофилизированный Loop опосредованных изотермических реагенты для амплификации для обнаружения Coxiella burnetii

Общей целью данного эксперимента является разработка простого метода LAMP с использованием лиофилизированных реагентов для обнаружения C.burnetii в образцах пациентов. Основное преимущество этого протокола заключается в том, что для хранения реагентов не требуется никакого обучения. Этот метод идеально подходит для использования в условиях ограниченных ресурсов, где лихорадка Ку является эндемичной.

Демонстрировать процедуру будет Татьяна, техник из нашей лаборатории. Начиная с ДНК гена-мишени IS1111a из C.burnetii RSA493, определите концентрацию плазмид с помощью спектрофотометра на 260 нанометрах. Преобразуйте концентрацию плазмидной ДНК в число копий с помощью следующих расчетов, где 6330 соответствует длине и парам оснований плазмиды, а 34,2 нанограмма на микролитр — концентрации плазмиды, только что определенной с помощью спектрофотометра.

Затем приготовьте 8-10-кратное серийное разведение плазмиды, чтобы получить следующее количество копий на микролитр. Чтобы подготовить матрицу ДНК для реакции LAMP, начните с 200 микролитров образцов плазмы крови человека, а с помощью набора для мини-подготовки ДНК извлеките ДНК в соответствии с протоколом производителя. Разведите итоговый образец до объема 20 микролитров.

Приготовьте 1 миллилитровый реакционный буфер 2x LAMP, комбинируя следующие реагенты. Перемешивайте импульсно-вихревым действием в течение 10 секунд. Чтобы провести стандартную реакцию LAMP, в 0,2 миллилитровой ПЦР-пробирке смешайте 12,5 микролитров 2x буфера LAMP, 1,2 микролитра смеси праймеров, 1 микролитр Bst ДНК-полимеразы и 5,3 микролитра воды.

Далее в реакцию 5 микролитров добавляем 20 микролитров ДНК и хорошо перемешиваем, после чего выдерживаем при температуре 60 градусов Цельсия на водяной бане или нагревательном блоке в течение 60 минут. После инкубации завершите реакцию, добавив в пробирку 5 микролитров 10-кратного буфера для загрузки геля. Затем загрузите 5 микролитров продуктов реакции в 2%-ный агарозный гель, окрашенный интеркалирующим веществом нуклеиновой кислоты.

Запустите гель в 1x TBE при напряжении 100 вольт в течение 35 минут, затем используйте ультрафиолетовый свет для визуализации результатов. Чтобы провести реакцию LAMP с восстановленными реагентами, приготовьте 1 миллилитр восстановительного буфера, соединив следующие реагенты. Перемешивайте импульсно-вихревым действием в течение 10 секунд.

Затем извлеките пробирки, в которых содержались лиофилизированные реактивы, из герметичного пакета из алюминиевой фольги. Для шага 4.2 очень важно убедиться, что пакет из алюминиевой фольги правильно запечатан перед его открытием. Не используйте трубки, если алюминиевый пакет не запечатан или поврежден.

Добавьте 20 микролитров восстановительного буфера в каждую пробирку с реагентами и перемешайте, пипетируя вверх и вниз пять раз. Убедитесь, что лиофилизированные реагенты полностью повторно суспендированы. Затем добавьте 5 микролитров матрицы ДНК к восстановленным реагентам и хорошо перемешайте.

Выдерживать при температуре 60 градусов Цельсия на водяной бане или нагревательном блоке в течение 60 минут. Чтобы завершить реакцию после инкубации, добавьте 5 микролитров 10-кратного буфера для загрузки геля, затем добавьте 5 микролитров продуктов реакции в 2%-ный агарозный гель, окрашенный интеркалирующим окрашиванием нуклеиновых кислот. Запустите гель в буфере 1x TBE при напряжении 100 вольт в течение 35 минут, затем визуализируйте результаты с помощью ультрафиолетового света.

Чтобы провести реакцию LAMP с гидроксинафтоловым синим, или HNB, или интеркаляционным красителем, приготовьте 1 миллилитр восстановительного буфера, комбинируя следующие реагенты, которые включают HNB или флуоресцентный интеркаляционный краситель. Перемешивайте импульсно-вихревым действием в течение 10 секунд. Проведите реакцию LAMP, как только что описано, и используйте ультрафиолетовый свет или невооруженным глазом для визуализации результатов.

Чтобы провести реакцию LAMP с помощью трубочного сканера, добавьте 5 микролитров ДНК к восстановленным реагентам, содержащим флуоресцентный интеркалирующий краситель, затем вставьте закрытую пробирку в пробирочный сканер. Установите температуру инкубации на 60 градусов Цельсия и измеряйте флуоресценцию на 520 нанометрах в течение 60 минут. На этом рисунке показаны результаты реакции LAMP на агарозных гелях со свежеприготовленными реактивами и лиофилизированными реактивами.

Наблюдайте за лиофилизированным реагентом, сохраняющим свою активность. В результате реакций LAMP, полученных обоими реагентами, было обнаружено 25 копий матрицы ДНК. На этом рисунке показано обнаружение продуктов реакции с помощью HNB или флуоресцентного интеркалирующего красителя в реакции.

Добавление HNB в реакцию приводит к визуальному изменению цвета от фиолетового до синего, при этом в реакциях присутствуют 25, 50 и 100 копий матрицы ДНК. Кроме того, включение флуоресцентного интеркаляционного красителя в реакцию показывает сильный флуоресцентный сигнал с ультрафиолетовым светом при наличии аналогичного количества копий ДНК. Здесь представлены результаты использования трубчатого сканера для мониторинга флуоресцентных сигналов в режиме реального времени с помощью флуоресцентного интеркаляционного красителя.

Флуоресцентные сигналы превышают исходный уровень через 14, 18, 21 и 23 минуты, при этом в реакциях участвуют 10^6, 10^4, 10^3 и 100 копий матрицы ДНК. После освоения эту процедуру можно проделать за 90 минут. После его разработки этот анализ проложил путь к быстрой диагностике инфекции Coxiella burnetii в районах с ограниченными ресурсами.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как восстанавливать лиофилизированные реагенты LAMP. Не забывайте, что образцы пациента могут быть инфекционными, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности.