Amplification, следующего поколения Секвенирование и геномную ДНК Mapping ретровирусных интеграции сайты

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы ПЦР амплифицировать сайты интеграции ретровирусной инфекции из объемной геномной ДНК и секвенировать полученную библиотеку ДНК таким образом, чтобы можно было сопоставить точные места интеграции с референсным геномом. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы фундаментальной и клинической ретровирусологии, анализируя распределение сайтов интеграции по всему геному хозяина. Основным преимуществом этого метода является глубина секвенирования ДНК, а также тот факт, что за один цикл может быть мультиплексировано много образцов.

За сутки до трансфекции поместите в 3,3 раза по 10 на шестую HEK293T клетки в 10 мл добавленной модифицированной Eagle's Medium от Dulbecco в каждой из пяти 100-миллиметровых посуд. На следующий день используйте коммерчески доступные реагенты для трансфекции или фосфат кальция для трансфекции клеток 10 микрограммами плазмиды, несущей полноразмерные ретровирусные молекулярные клоны, или девятью микрограммами оболоченных одиночных круглых векторов плюс один микрограмм экспрессирующей конструкции VSV-G. Добавляйте смесь в клеточную среду по каплям.

После трансфекции инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в увлажнённом инкубаторе для клеточных культур с 5% углекислым газом. Примерно через 48 часов соберите вируссодержащую клеточную среду с помощью объемной пипетки и пропустите ее через фильтр размером 0,45 микрона под действием силы тяжести. Затем сконцентрируйте вирус с помощью ультрацентрифугирования при 200 000 G в течение одного часа при четырех градусах Цельсия.

После центрифугирования удалите надосадочную жидкость до тех пор, пока не останется примерно 500 микролитров DMEM FPS, и повторно суспендируйте вирусную гранулу. Добавьте 20 единиц ДНКазы и инкубируйте в течение часа при температуре 37 градусов Цельсия. Определите концентрацию p24 с помощью набора для захвата антигена HIV-1 p24 в соответствии с инструкциями производителя.

За сутки до заражения планшет 3,0 раз по 10 на пятый HEK293T клетки по 2,5 мл DMEM FPS на лунку в шестилуночный планшет и инкубируют в течение ночи в инкубаторе для культуры тканей. Заражайте клетки с конечной концентрацией вируса p24 500 нанограмм на миллилитр в 500 микролитрах свежего DMEM FPS. Инкубировать в течение двух часов в инкубаторе для тканевых культур.

Через два часа добавьте в каждую лунку по два миллилитра предварительно подогретого до 37 градусов Цельсия DMEM FPS и верните тарелку в инкубатор. Через 48 часов после заражения удалите среду и промойте клетки двумя миллилитрами фосфатно-солевого буфера. Соберите клетки, добавив 0,5 миллилитра трипсина-ЭДТА, предварительно нагретого до 37 градусов Цельсия, и через несколько секунд визуально осмотрите лунки на предмет смещения клеток.

Затем добавьте два миллилитра предварительно подогретого DMEM FPS и повторно суспендируйте клетки, аккуратно пипетируя вверх и вниз 10 раз с помощью объемной пипетки. Перелейте раствор в колбу для культуры тканей площадью 75 квадратных сантиметров, содержащую 18 миллилитров предварительно подогретого DMEM FPS, и верните в инкубатор для тканевых культур. Не менее чем через пять дней после заражения соберите клетки, как и раньше, и повторно суспендируйте в пяти миллилитрах предварительно подогретого DMEM FPS с помощью пипетирования.

Центрифугируйте раствор в течение пяти минут при комнатной температуре при 2 500 G, затем аспирируйте и выбросьте надосадочную жидкость. Наконец, извлеките геномную ДНК из клеточной гранулы с помощью коммерчески доступного набора. Элюируйте ДНК из прилагаемой ионообменной колонки 200 микролитрами миллимолярного Tris-HCL при pH 8,5.

После ультразвуковой обработки геномной ДНК очистите обработанную ультразвуком ДНК с помощью набора для очистки ПЦР. Затем восстановите ДНК с помощью конечного ремонтного набора. После очистки ДНК, как и раньше, хвост ДНК осуществляется с помощью фермента Klenow Exo-Minus.

В качестве альтернативы, для фрагментации путем расщепления эндонуклеазы рестрикции, разрежьте геномную ДНК коктейлем ферментов, которые генерируют выступы 5'TA, а также несовместимый фермент, такой как BglII, который расщепляется ниже по потоку от вышестоящего вирусного LTR. Разрежьте 10 микрограммов геномной ДНК в итоговом объеме 100 микролитров. Инкубировать в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия.

Убедитесь, что окончательная ДНК очищена с помощью набора для очистки ПЦР. Линкер, используемый с ультразвуковой ДНК, должен содержать совместимый T 3'выступ, в то время как линкер для расщепленной MseI ДНК должен содержать совместимый 5'TA выступ. Начните с отжига 10 микромоляров коротких и длинных линкерных нитей в 35 микролитрах буфера Tris-HCL EDTA путем нагревания до 90 градусов Цельсия и медленного охлаждения до комнатной температуры с шагом в один градус Цельсия в минуту.

Затем готовят не менее четырех параллельных реакций лигирования для каждого образца геномной ДНК, содержащего 1,5 микромолярного лигированного линкера, один микрограмм фрагментированной ДНК и 800 единиц Т4 ДНК-лигазы в конечном объеме 50 микролитров. Лигат на ночь при 12 градусах по Цельсию. Для образцов, полученных методом ультразвуковой обработки, очищенную реакцию лигирования расщепляют ферментом рестрикции, который расщепляется ниже по потоку от предшествующего LTR.

Используйте 100 единиц соответствующего фермента в рекомендованных производителем условиях в течение ночи. Убедитесь, что готовые продукты очищены с помощью набора для очистки ПЦР. Приготовьте ПЦР первого раунда с использованием показанных здесь реагентов.

Запустите первый раунд ПЦР с использованием следующих параметров: 94 градуса Цельсия в течение двух минут, затем 30 циклов по 94 градуса Цельсия в течение 15 секунд, 55 градусов Цельсия в течение 30 секунд, 68 градусов Цельсия в течение 45 секунд. Готовьте при температуре 68 градусов Цельсия в течение 10 минут. Объедините реакции первого раунда и очистите ДНК, как и раньше.

Затем приготовьте ПЦР второго раунда, содержащие показанные здесь реагенты. Используйте те же параметры цикла, что и для ПЦР первого раунда. После объединения и очистки ДНК из реакции второго раунда проведите контроль качества и секвенирование следующего поколения, а также проанализируйте сайты интеграции с использованием подробных инструкций в письменной части протокола.

Сайты интеграции из библиотек, подготовленных методом расщепления с помощью ферментов рестрикции, как показано слева, или ультразвуковой обработки, как показано справа, были выровнены с помощью программного обеспечения для создания веб-логотипов. Изображено каждое разведение в серии титрования, от аккуратной ДНК в верхней части рисунка до максимального разведения от одного до 15 625 в нижней части. Степень достоверности снижается с увеличением разведения инфицированной клеточной ДНК.

На этом изображении показан логотип последовательности для совпадающего случайного контроля 50 000 уникальных геномных сайтов. Обратите внимание, что случайные сайты, выровненные по набору данных MRC, напротив, не смогли создать заметные уровни базовых предпочтений. После освоения библиотеки сайтов интеграции могут быть подготовлены из геномной ДНК за три дня.

Таким образом, картирование интеграционного сайта, от первоначального заражения до завершения биоинформатики, может быть завершено примерно за две недели. Следуя этой процедуре, можно каталогизировать тысячи или даже миллионы уникальных сайтов ретровирусной интеграции, а также провести различные анализы для количественной оценки ассоциаций между сайтами вставки и геномными аннотациями.