Amplification, следующего поколения Секвенирование и геномную ДНК Mapping ретровирусных интеграции сайты

Общая цель данной процедуры заключается в ПЦР-амплификации сайтов интеграции ретровирусов из общей геномной ДНК и последующем секвенировании полученной библиотеки ДНК для точного картирования мест интеграции относительно референсного генома. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы фундаментальной и клинической ретровирусологии путем анализа распределения сайтов интеграции по всему геному хозяина. Основным преимуществом данной методики является глубина секвенирования ДНК, а также возможность мультиплексирования множества образцов в одном цикле секвенирования.

За один день до трансфекции высейте 3,3 × 10⁶ клеток HEK293T в 10 мл дополненной модифицированной среды Игла в модификации Дульбекко в каждую из пяти 100-мм чашек. На следующий день используйте коммерчески доступные реагенты для трансфекции или фосфат кальция, чтобы трансфицировать клетки 10 мкг плазмиды, содержащей полноразмерные ретровирусные молекулярные клоны, или 9 мкг оболочечных элидированных векторов одного цикла в сочетании с 1 мкг экспрессионной конструкции VSV-G. Добавляйте смесь в среду для клеток по каплям.

После трансфекции инкубируйте клетки при 37 °C в увлажненном инкубаторе для культур клеток с 5% carbon dioxide. Примерно через 48 часов соберите среду из культур клеток, содержащую вирус, с помощью градуированной пипетки и пропустите ее через фильтр с порами 0.45 micron путем гравитационного фильтрования. Затем сконцентрируйте вирус методом ультрацентрифугирования при 200, 000 Gs в течение одного часа при 4 °C.

После центрифугирования удалите супернатант, оставив примерно 500 µL DMEM FPS, и ресуспендируйте вирусный осадок. Добавьте 20 units DNase и инкубируйте в течение одного часа при 37 °C. Определите концентрацию p24, используя набор для захвата антигена HIV-1 p24 в соответствии с инструкциями производителя.

За день до инфицирования высейте 3,0 × 10⁵ клеток HEK293T в 2,5 мл среды DMEM FPS на лунку в шестилуночный планшет и инкубируйте в течение ночи в инкубаторе для культур тканей. Инфицируйте клетки, используя конечную концентрацию вирусного белка p24 500 нг/мл в 500 мкл свежей среды DMEM FPS. Инкубируйте в течение двух часов в инкубаторе для культур тканей.

Через два часа добавьте в каждую лунку по два миллилитра DMEM FPS, предварительно нагретого до 37 °C, и верните планшет в инкубатор. Через 48 часов после инфицирования удалите среду и промойте клетки двумя миллилитрами фосфатно-солевого буферного раствора. Соберите клетки, добавив 0,5 миллилитра Trypsin-EDTA, предварительно нагретого до 37 °C, и через несколько секунд визуально проверьте лунки на предмет открепления клеток.

Затем добавьте два миллилитра предварительно подогретого DMEM FPS и ресуспендируйте клетки, осторожно перенося их туда и обратно пипеткой 10 раз с помощью градуированной пипетки. Перенесите раствор в флакон для культивирования тканей объемом 75 квадратных сантиметров, содержащий 18 миллилитров предварительно подогретого DMEM FPS, и верните его в инкубатор для культивирования тканей. Минимум через пять дней после инфицирования соберите клетки, как описано ранее, и ресуспендируйте их в пяти миллилитрах предварительно подогретого DMEM FPS путем пипетирования.

Центрифугируйте раствор в течение пяти минут при комнатной температуре при 2 500 Gs, затем аспирируйте и удалите супернатант. В завершение выделите геномную ДНК из клеточного осадка с помощью имеющегося в продаже набора. Элюируйте ДНК с прилагаемой ионообменной колонки, используя 200 µL миллимолярного Tris-HCL при pH 8.5.

После соникации геномной ДНК очистите соникатированную ДНК с помощью набора для очистки ПЦР-продуктов. Затем проведите репарацию концов ДНК, используя набор для восстановления концов. После повторной очистки ДНК, как описано выше, проведите A-хвостирование ДНК с помощью фермента Klenow Exo-Minus.

В качестве альтернативы, для фрагментации путем рестрикции, обработайте геномную ДНК коктейлем ферментов, создающих 5'-TA выступающие концы, а также несовместимым ферментом, таким как BglII, который осуществляет расщепление ниже по течению от вышележащего вирусного LTR. Проведите расщепление 10 µg геномной ДНК в конечном объеме 100 µL. Инкубируйте в течение ночи при 37 °C.

Убедитесь, что конечный продукт ДНК очищен с помощью набора для очистки ПЦР. Линкер, используемый для соникарованной ДНК, должен содержать совместимый 3'-выступ T, в то время как линкер для ДНК, переваренной MseI, должен содержать совместимый 5'-выступ TA. Начните с отжига короткой и длинной цепей линкера в концентрации 10 µM в 35 µL буфера Tris-HCL EDTA путем нагревания до 90 °C и медленного охлаждения до комнатной температуры со скоростью 1 °C в минуту.

Затем подготовьте не менее четырех параллельных реакций лигирования для каждого образца геномной ДНК, содержащих 1.5 µM лигированного линкера, 1 µg фрагментированной ДНК и 800 units Т4 ДНК-лигазы в конечном объеме 50 µL. Проводите лигирование в течение ночи при 12 °C. Для образцов, подготовленных методом соникации, подвергните очищенную реакционную смесь лигирования расщеплению рестриктазой, которая вносит разрез ниже по течению от апстрим-LTR.

Используйте 100 единиц соответствующего фермента в течение ночи в условиях, рекомендованных производителем. Убедитесь, что конечные продукты очищены с помощью набора для очистки ПЦР-продуктов. Подготовьте ПЦР первого раунда, используя представленные здесь реагенты.

Проведите первый раунд ПЦР со следующими параметрами: 94 °C в течение двух минут, затем 30 циклов по 94 °C в течение 15 секунд, 55 °C в течение 30 секунд, 68 °C в течение 45 секунд. Завершите реакцию выдержкой при 68 °C в течение 10 минут. Объедините результаты первого раунда реакций и очистите ДНК, как описано ранее.

Затем подготовьте ПЦР второго раунда, используя реагенты, указанные здесь. Используйте те же параметры циклирования, что и для ПЦР первого раунда. После объединения и очистки ДНК из реакций второго раунда проведите контроль качества и секвенирование следующего поколения, а затем проанализируйте сайты интеграции, следуя подробным инструкциям в текстовой части протокола.

Сайты интеграции из библиотек, подготовленных путем рестрикции с помощью рестриктаз (слева) или соникации (справа), были выровнены с использованием программного обеспечения для создания веб-логотипов. На рисунке представлены все разведения в серии титрования: от исходной ДНК в верхней части до максимального разведения 1 к 15 625 в нижней. Степень достоверности снижается по мере увеличения разведения ДНК инфицированных клеток.

На этом изображении представлен логотип последовательности для подобранного случайного контроля из 50 000 уникальных геномных сайтов. Обратите внимание, что случайные сайты, выровненные по набору данных MRC, напротив, не продемонстрировали значимых уровней предпочтения оснований. После освоения методики библиотеки сайтов интеграции могут быть подготовлены из геномной ДНК за три дня.

Таким образом, картирование сайтов интеграции — от первоначального заражения до завершения биоинформатического анализа — может быть выполнено примерно за две недели. После проведения этой процедуры можно каталогизировать тысячи или даже миллионы уникальных сайтов ретровирусной интеграции, а также провести различные анализы для количественной оценки взаимосвязей между сайтами вставки и геномными аннотациями.