Нейтрофильная Выделение и анализ для определения их роли в клеточной лимфомы чувствительность к терапевтических агентов

Нейтрофилы являются наиболее распространенным типом белых кровяных телец. Описаны выделение нейтрофилов из крови человека методом разделения градиента плотности и дифференцировка промиелоцитарных (HL60) клеток человека по гранулоцитарному пути; Проверить их роль в чувствительности клеток лимфомы к антилимфомным агентам.

Общая цель этих процедур заключается в быстром выделении высокоочищенных нейтрофилов из образцов крови человека путем центрифугирования с градиентом плотности для исследования их роли в чувствительности клеток лимфомы к терапии рака с использованием двух моделей культуры D-клеток и трех D-клеток. Эти методы могут помочь ответить на ключевые вопросы о взаимодействии между врожденной иммунной системой и раком, например, какую роль играют опосредованные нейтрофильными опухолевыми клетками в терапии рака. Основным преимуществом разделения по градиенту плотности является возможность изолировать чистые иммунные клеточные популяции за короткий период времени, не подвергая клетки воздействию стимулов, изменяющих функцию.

Чтобы изолировать первичные лейкозные клетки и нейтрофилы, начните с добавления 15 миллилитров обработанной ЭДТА крови из образцов пациентов с хроническим лимфоцитарным лейкозом в индивидуальные стерильные 50-миллилитровые пробирки. Разбавьте кровь 15 миллилитрами РПМИ. Затем осторожно и медленно добавьте под кровь 15 миллилитров градиентного раствора комнатной температуры, стараясь не перемешать слои.

После разделения клеток с помощью центрифугирования будут видны четыре отдельные фазы. Тромбоциты и плазма вверху, белое кольцо мононуклеарных клеток, раствор градиента плотности, а внизу гранулоциты и эритроциты. С помощью пластиковой пастбищной пипетки сначала перенесите белое кольцо первичных лейкозных клеток в новую 50-миллилитровую пробирку.

Промойте клетки до 50 миллилитров PBS с кальцием и магнием. И повторно суспендируйте нёбо в пяти миллилитрах свежей PBS. Затем добавьте еще 45 миллилитров PBS в клетки и снова поверните клетки вниз.

После второго промывания снова суспендируйте нёбо в полной среде RPMI. И посчитайте количество жизнеспособных первичных лейкозных клеток. Далее удалите плазму тромбоцитов и слои градиента плотности, а в эритроцитарную фазу гранулоцитов добавьте 25 миллилитров PBS и 25 миллилитров Декстрина в хлориде натрия.

Перемешайте трубки десять раз методом инверсии. Затем дайте ячейкам отстояться в течение 30 минут при комнатной температуре. В конце уравновешивания перенесите верхний слой нейтрофилов эритроцитов в стерильную 50-миллилитровую пробирку и раскрутите клетки вниз.

Восстановите суспендию неба в пяти миллилитрах PBS и лизируйте эритроциты с помощью 45 миллилитров буфера для лизиса эритроцитов. После 15 минут в темноте при комнатной температуре снова раскрутите клетки и промойте нёбо в 50 миллилитрах PBS. В конце промывки повторно суспендируйте клетки в полной среде RPMI и подсчитайте количество жизнеспособных нейтрофилов.

Разбавьте обе группы клеток до 300 000 клеток на 50 микролитров концентрации RPMI и разделите образцы между соответствующим количеством пятимиллилитровых факсимильных трубок. После центрифугирования повторно суспендируйте гранулы в 50 микролитрах PBS с добавлением FBS. Чтобы определить чистоту выделенных подмножеств клеток, пометьте аликвант первичных лейкозных клеток антителом против человеческого CD19, конъюгированным с APC, и аликвант очищенных нейтрофилов смесью антител против человека, как указано в таблице, в течение 30 минут в темноте при четырех градусах Цельсия.

В конце инкубации промойте клетки в 500 микролитрах FBS с дополнением PBS и повторно суспендируйте нёбо в 200 микролитрах свежего FBS PBS. Затем проанализируйте чистоту клеточных популяций с помощью проточной цитометрии, уделяя особое внимание цветовой компенсации образцов. Для совместного культивирования первичных лейкозных клеток с нейтрофилами аутолога смотрите 200 000 клеток на миллилитр лейкозных клеток отдельно или с нейтрофилами аутолога в 24-луночном планшете в полной среде RPMI.

Тщательно перемешайте ячейки. Затем обрабатывайте клетки ингибитором тирозинкиназы Бруттона в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия и пяти процентах CO2. На следующий день соберите аликвант клеток в пятимиллилитровую пластиковую факсимильную трубку.

Затем раскрутите ячейки и промойте гранулы в одном миллилитре FBS PBS. После второго центрифугирования пометьте клетки анинексином пятью и йодидом пропидия в соответствии с инструкцией производителя в течение десяти минут при комнатной температуре в темноте. Затем проанализируйте нейтрофилы и первичные лейкозные клетки с помощью проточной цитометрии с использованием проиллюстрированной стратегии гейтирования.

Чтобы создать кокультуру с тремя D, добавьте 50 000 RL b-клеток лимфомы по отдельности или смешайте с дифференцированными клетками HL60 в стерильных 15-миллилитровых пробирках. Раскрутите образцы и повторно суспендируйте гранулы в 300 микролитрах матрицы базальной мембраны, используя одномиллиметровый наконечник для пипетки с отверстием, срезанным до двух-трех миллиметров. Затем инкубируйте по 300 микролитров клеток в каждой лунке 24-луночного планшета в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия и пяти процентах CO2.

В конце инкубации добавьте по одному миллилитру полной среды RPMI в каждую лунку и верните трехмерные культуры в инкубатор еще на семь дней с подменой среды каждые два дня. На пятый день добавьте к культурам десять наномоляров инкристина. После одной недели культивирования аспирируйте среду и промойте каждую лунку два раза одним миллилитром ледяного PBS.

Затем добавьте три миллилитра ледяного PBS с ЭДТА в каждую лунку и соскребите дно лунок наконечником пипетки объемом 200 микролитров, чтобы отделить гели. Аккуратно встряхните тарелку на льду в течение 30 минут. Затем переложите клеточные суспензии в отдельные стерильные 15 миллилитровые пробирки для легкого встряхивания на льду еще 30 минут.

Подтвердите появление однородной клеточной суспензии. Затем раскрутите ячейки с последующей промывкой PBS и повторно суспендируйте гранулы в свежих PBS с FBS. Наконец, помечайте клетки соответствующими антителами и красителями жизнеспособности, как показано выше, и анализируйте дифференцированные клетки RL и HL60 с помощью проточной цитометрии с использованием проиллюстрированной стратегии гейтирования.

Анализ всех событий выделенных клеточных популяций с помощью проточной цитометрии показывает, что этот метод разделения приводит к получению высокочистой популяции первичных лейкозных клеток с одним пиком CD19. И более 90 процентов чистой популяции нейтрофилов, положительной на общие антигены лейкоцитов CD45, а также антигены CD15 и CD16, экспрессируемые зрелыми нейтрофилами. Ходьба по первичным лейкозным клеткам из культур ко-нейтрофилов показывает, что нейтрофилы оказывают протективное действие на выживаемость клеток против ингибитора тирозина ибрутиниба при значительно большем количестве жизнеспособных первичных лейкозных клеток по сравнению с культурой только первичных лейкозных клеток.

Дифференцированные клетки HL60 более стабильны в трех D-культурах, чем нейтрофилы. После индукции их гранулоцитарного развития эти клетки меньше, чем недифференцированные клетки HL60, и экспрессируют более высокие уровни CD11B и CD38. Дифференцированные клетки HL60 также демонстрируют многолопастные ядра.

Эти клетки проявляют защитное действие на клетки RL со значительно большим количеством жизнеспособных RL-клеток в трех культурах D-co после лечения винкростином по сравнению с обработанными винкростином клетками лимфомы, культивируемыми отдельно. После освоения метод центрифугирования с градиентом плотности может быть завершен за 90 минут. После их разработки эти методы проложили путь исследователям в области биологии рака к изучению влияния различных белых кровяных клеток на злокачественность опухоли в доклинических моделях и образцах пациентов.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как быстро и надежно изолировать мононуклеарные клетки и нейтрофилы, проанализировать влияние нейтрофилов на посредничество реакции опухолевых клеток на противораковые препараты и создать культуру с тремя D co.