Вглядываясь мозга полисом с атомно-силовой микроскопии

Общая цель данного протокола — предоставить детальный алгоритм для точной очистки и осаждения полирибосом головного мозга на слюду и получения тысяч изображений с наноразмерным разрешением без необходимости в интенсивной постобработке или анализе 3D-реконструкции. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области трансляции и трансляционного контроля, такие как понимание влияния организации рибосом внутри полисом при перестройке экспрессии генов. Основными преимуществами данного метода являются отсутствие необходимости в фиксации или маркировке образцов, а также возможность проведения измерений в условиях, близких к физиологическим, что позволяет легко идентифицировать рибосомы и «голые» нити РНК.

Хотя данный метод позволяет получить представление об организации полисом млекопитающих, его также можно применять к другим микроорганизмам, таким как дрожжи, бактерии и насекомые, а также для изучения состояний, связанных с трансляционным контролем экспрессии генов. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку работа с полисомальным образцом при адсорбции на слюду и этапы промывки довольно сложны и требуют определенных навыков и опыта. Процедуру продемонстрируют Паола Бернабо и Лоренцо Лунелли.

Для начала соберите и заморозьте ткани мозга согласно описанию в прилагаемом текстовом протоколе. Затем извлеките замороженную ткань из морозильной камеры и перенесите ее на рабочий стол. Поместите замороженную ткань мозга и жидкий азот в предварительно охлажденную ступку и растирайте пестиком до получения порошкообразного состояния.

Перенесите около 25 мг порошка мозга в охлажденную микроцентрифужную пробирку и немедленно добавьте 0,8 мл лизирующего буфера. Быстро перемешайте смесь, 25 раз прокачав её через дозатор, чтобы разрушить клетки. Затем центрифугируйте пробирку при 12 000 ×g в течение одной минуты при температуре четыре °C для осаждения клеточного дебриса.

Перенесите супернатант в новую микроцентрифужную пробирку и выдержите её на льду в течение 15 минут. Затем центрифугируйте пробирку в течение пяти минут для осаждения ядер и митохондрий. После этого осторожно снимите один миллилитр из верхней части предварительно подготовленного градиента сахарозы.

Послойно нанесите супернатопт цитозольного лизата на слой сахарозы, добавляя его по каплям. После нанесения образца на верхнюю часть градиента осторожно поместите пробирку и противовесную пробирку в корзины ротора с маятниковыми стаканами. Центрифугируйте градиент в течение 100 минут.

После ультрацентрифугирования оставьте пробирки в штативе на 20 минут при температуре 4 °C для стабилизации градиента. Затем осторожно извлеките пробирку с образцом и установите ее в устройство сбора фракций системы фракционирования градиента плотности. Соберите фракции объемом по 1 мл, контролируя абсорбцию нуклеиновых кислот при 260 нм с помощью УФ-детектора, и поместите их на лед.

Затем приготовьте аликвоты по 30-40 µL интересующих фракций и храните их на льду. Если образцы не будут использованы сразу, храните их при температуре -80 °C, стараясь ограничить количество циклов замораживания-оттаивания. Для подготовки образцов к AFM-визуализации сначала покройте промытый лист слюды 200 µL 1 мМ сульфата никеля(II) и выдержите лист в течение трех минут при комнатной температуре.

Затем удалите раствор, просушите поверхность сжатым воздухом и поместите чашку Петри на лед. Далее осторожно и по капле добавьте на слюду всю аликвоту интересующей фракции. Используя наконечник объемом 100 или 200 мкл, распределите образец по всей поверхности слюды и инкубируйте образец на льду в течение трех минут.

Затем по каплям покройте слюдяную пластинку 200 µL холодного буфера AFM и инкубируйте образец на льду в течение одного часа. Поддержание температуры образца на уровне 4 °C и использование холодного буфера, приготовленного на воде, свободной от РНказ, имеют важное значение для сохранения организации полирибосом. После инкубации осторожно удалите буфер и промойте слюду три-четыре раза 200 µL холодного буфера AFM, чтобы удалить излишки сахарозы.

Затем трижды промойте слюду холодным промывочным раствором и удалите излишки воды с поверхности слюды с помощью бумажных салфеток. Полное удаление сахарозы из абсорбированных образцов имеет решающее значение, так как на данном этапе вы разделили рибосомы и свободную РНК в полисоме. Оставьте образец высыхать под вытяжным шкафом, частично приоткрыв крышку чашки Петри.

Через два часа закройте чашку Петри. Теперь образец можно хранить при комнатной температуре. Закрепите подготовленный образец на держателе образцов АСМ с помощью двустороннего скотча.

Затем установите держатель образца в модуль АСМ в соответствии с инструкциями производителя. После калибровки подведите зонд к образцу до тех пор, пока кончик кантилевера не вступит в контакт с поверхностью. Выберите область сканирования размером 2 x 2 мкм, разрешение не менее 512 x 512 пикселей, режим вычитания фона в реальном времени (live background subtraction) и масштаб по оси Z в диапазоне 20-25 нм.

Затем начните сбор изображений. При анализе изображений, полученных в воздушной среде, убедитесь в наличии округлых объектов с высотой от 10 до 15 нанометров. Далее отрегулируйте уставку и параметры обратной связи до тех пор, пока объекты не станут четко визуализироваться.

На качественных образцах фон должен выглядеть относительно плоским с наличием отдельных объектов высотой от двух до четырех нанометров. Когда изображение станет удовлетворительным, проведите несколько сканирований размером 2 × 2 микрона в разных областях образца. После нанесения аликвот сахарозы на слюду метод АСМ позволяет получить точные характеристики размеров единичных полисом, которые выглядят как скопления плотно упакованных рибосом.

Более детальное рассмотрение одного из рибосомальных пиков с помощью анализа поперечного сечения показывает, что высота рибосомальных пиков составляет около 14 nanometers. Это соответствует данным, полученным ранее для рибосом и полисом человека после высушивания на воздухе. На изображении справа был использован макрос для определения местоположения рибосом и маркировки каждой рибосомы красным кругом.

Используя эти данные, можно проанализировать распределение частоты количества рибосом на одну полисому. Данное экспериментальное распределение было аппроксимировано кривой Гаусса с центром в точке 5,8 рибосом на полисому и стандартным отклонением 1,3. При должном навыке весь процесс — от измельчения тканей мозга до получения изображений полирибосом — может быть выполнен менее чем за восемь часов при соблюдении правильной техники.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости содержать образец на льду и использовать холодные буферы для осаждения образца на слюду. Следуя этому протоколу и используя плагин ImageJ, разработанный для представления в вашей статье, вы сможете точно подсчитать количество рибосом на одну полисому. В дальнейшем этот метод позволит изучить кинетику образования полисом, а также выявить изменения в организации полисом при различных клеточных или тканевых условиях.

После просмотра этого видео вы получите четкое представление о том, как получить тысячи изображений полисом для их систематического анализа и изучения их организации.