Вглядываясь мозга полисом с атомно-силовой микроскопии

Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы предоставить подробный конвейер для точной очистки и осаждения полирибосом мозга на слюде, а также получить тысячи изображений с наноразмерным разрешением без необходимости тяжелой постобработки или 3D-реконструкции. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области трансляции и трансляционного контроля, такие как понимание влияния организации рибосом в полисомах во время перестройки экспрессии генов. Основные преимущества этого метода заключаются в том, что не требуется фиксация образца или маркировка, а измерения могут быть проведены в условиях, приближенных к физиологическим, чтобы легко идентифицировать рибосомы и голые стойки РНК.

Хотя этот метод может дать представление об организации полирибосомы млекопитающих, он также может быть применен к другим микроорганизмам, таким как дрожжи, бактерии и насекомые, а также к статусу, включающему трансляционный контроль экспрессии генов. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как работа с полисомальным образцом для абсорбции слюды и этапы промывки довольно сложны и требуют навыков и опыта работы с ними. Демонстрировать процедуру будут Паола Бернабо и Лоренцо Лунелли.

Для начала соберите и заморозьте мозговую ткань, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Затем вытащите замороженную ткань из морозилки и принесите ее на скамейку. Поместите замороженную мозговую ткань и жидкий азот в предварительно охлажденную ступку и измельчите ее с помощью пестика до образования порошка.

Переложите около 25 миллиграммов порошка мозга в холодную микроцентрифужную пробирку и сразу же добавьте 0,8 миллилитра буфера для лизиса. Быстро пипеткой вверх и вниз 25 раз, чтобы нарушить работу клеток. Затем центрифугируйте пробирку при 12 000 x g в течение одной минуты при четырех градусах Цельсия, чтобы измельчить клеточный мусор.

Переложите надосадочную жидкость в новую микроцентрифужную пробирку и подержите пробирку на льду в течение 15 минут. Затем центрифугируйте в пробирке в течение пяти минут, чтобы гранулировать ядра и митохондрии. Далее аккуратно удалите один миллилитр из верхушки заранее подготовленного градиента сахарозы.

Посыпьте сахарозу по капле надосадочной жидкостью из цитозольного лизата. Теперь, когда образец загружен на вершину градиента, осторожно опустите трубку и противовесную трубку в ковши качающегося ротора ковша. Центрифугируйте градиент в течение 100 минут.

После ультрацентрифугирования оставьте пробирки в ведре на 20 минут при температуре четыре градуса Цельсия, чтобы градиент стабилизировался. Затем осторожно снимите пробирку с образцом и установите ее на коллекторное устройство системы фракционирования градиента плотности. Соберите доли в одном миллилитре, контролируя поглощение нуклеиновых кислот на глубине 260 нанометров с помощью детектора видимого ультрафиолетового света, и положите их на лед.

Далее приготовьте 30-40 микролитров аликвот интересующих фракций, и держите их на льду. Если образцы не будут использоваться сразу, храните их при температуре 80 градусов Цельсия и примите меры по ограничению количества циклов замораживания-размораживания. Чтобы подготовить образцы для АСМ визуализации, сначала накройте промытый лист слюды 200 микролитрами одного миллимоляра сульфата никеля II и инкубируйте лист в течение трех минут при комнатной температуре.

Затем удалите раствор, высушите поверхность сжатым воздухом и поставьте чашку Петри на лед. Далее аккуратно добавляем всю аликвоту из интересующей по капле на слюду. С помощью наконечника объемом 100 или 200 микролитров распределите образец по всей поверхности слюды, и инкубируйте образец на льду в течение трех минут.

Затем покройте лист слюды по каплям 200 микролитрами холодного буферного АСМ и инкубируйте образец на льду в течение одного часа. Поддержание образца при температуре 40 градусов и использование холодного буфера, приготовленного в воде, не содержащей РНКазы, важны для сохранения полирибосомной организации. После инкубации осторожно снимите буфер и промойте слюду три-четыре раза 200 микролитрами холодного буфера AFM, чтобы удалить излишки сахарозы.

Затем трижды промойте слюду холодным моющим раствором и слейте лишнюю воду со слюды с помощью бумаги. Полное удаление сахарозы из образцов абсорбента имеет решающее значение теперь, когда вы разорвали как рибосому, так и голую РНК в полисоме. Оставьте образец сохнуть под химическим колпаком с частично открытой верхней частью чашки Петри.

Через два часа закройте чашку Петри. Теперь образец можно хранить при комнатной температуре. Прикрепите подготовленный образец к держателю образца АСМ с помощью двустороннего скотча.

Затем вставьте держатель образца в столик АСМ в соответствии с инструкциями производителя. После калибровки приближайтесь к образцу до тех пор, пока кончик кантилевера не войдет в зацепление с поверхностью. Выберите область сканирования размером два на два микрона, разрешение не менее 512 x 512 пикселей, выберите режим вычитания фона в реальном времени и выберите Z-масштаб 20-25 нанометров.

Затем начните получение изображения. Изучите изображение, ища наличие круглых объектов, характеризующихся высотой от 10 до 15 нанометров при получении изображений в воздухе. Далее отрегулируйте заданное значение и параметры обратной связи до тех пор, пока не будут визуализированы острые объекты.

Фон должен выглядеть относительно плоским в хороших образцах с объектами высотой от двух до четырех нанометров. Как только изображение будет выглядеть хорошо, получите несколько сканов размером два на два микрона в разных областях образца. После осаждения аликвот сахарозы на слюду АСМ дает точное описание размеров отдельных полисом, которые выглядят как кластеры плотно упакованных рибосом.

Более пристальный взгляд на один из рибосомных пиков с помощью анализа поперечного сечения показывает, что высота рибосомных пиков составляет около 14 нанометров. Это соответствует тому, что ранее наблюдалось для рибосом и полисом человека после сушки на воздухе. На изображении справа макрос был использован для определения местоположения рибосом и пометки каждой рибосомы красным кругом.

Используя эту информацию, можно проанализировать частотное распределение числа рибосом на полисому. Это экспериментальное распределение было дополнено кривой Гаусса, которая была центрирована на уровне 5,8 рибосом на полисому, со стандартным отклонением 1,3. После освоения эта техника от измельчения мозга до получения изображений полирибосом может быть выполнена менее чем за восемь часов, если она выполнена правильно.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о необходимости держать образец на льду и использовать холодные буферы для осаждения образца на слюду. Следуя этой процедуре и используя плагин ImageJ разработчика, который будет доступен в вашей статье, вы можете точно подсчитать количество рибосом на полисому. После каждой разработки этот метод проложит путь к пониманию кинетики образования полисом и выявлению изменений в организации полисом и их различных клеточных или тканевых состояний.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как получить тысячи полисомных изображений для систематического анализа и изучения их организации.