Изготовление и эксплуатация Acoustofluidic устройств с поддержкой объемных акустических стоячих волн для без футляра фокусировки частиц

Общая цель данного метода изготовления заключается в создании универсального и надежного акустофлюидного устройства для бесконтактного манипулирования коллоидными частицами микронного размера с помощью объемных акустических стоячих волн. Мы стремимся продемонстрировать простой подход, показав, как изготовить акустофлюидные инструменты, поддерживающие объемные акустические стоячие волны, используя стандартное оборудование и процедуры, в надежде сделать эту полезную технологию более доступной. Основным преимуществом акустофлюидики является то, что она предлагает простой способ быстрого фокусирования или разделения микроскопических объектов, что имеет широкое применение в чиповой цитометрии и сортировке клеток.

Данная технология позволяет упорядочивать частицы при различных скоростях потока бережным и избирательным образом, причем всё это реализовано на удобной миниатюризированной платформе. В чистом помещении поместите чистую одностороннюю полированную кремниевую пластину диаметром шесть дюймов на центрифугу для нанесения покрытий полированной стороной вверх. Нанесите позитивный фоторезист непосредственно в центр пластины, осторожно наливая его до тех пор, пока фоторезист не покроет большую часть поверхности пластины.

Затем подвергните образец центрифугированию для получения равномерного слоя фоторезиста. По завершении снимите вакуум с чака и извлеките пластину с помощью пинцета для пластин. Далее поместите пластину на нагревательную плитку и проведите мягкий засвет (soft bake) в течение времени, указанного поставщиком фоторезиста.

Пока фоторезист запекается, установите фотошаблон, подобный представленному здесь, в держатель установку для экспонирования. Затем установите пластину и подвергните её воздействию УФ-излучения с дозой энергии, указанной поставщиком фоторезиста. После этого извлеките пластину с нанесенным фотопаттерном из держателя и поместите её в раствор соответствующего проявителя.

По завершении извлеките пластину из проявителя, промойте ее под непрерывной струей деионизированной воды и высушите потоком азота. Поместите пластину с фотошаблоном в камеру установки для глубокого реактивного ионного травления и вытравите в пластине флюидные каналы до нужной глубины, следуя стандартным процедурам травления. После завершения процесса травления извлеките образец из камеры и поместите его в большой стакан с раствором для удаления фоторезиста.

Убедитесь, что подложка полностью погружена в раствор, и оставьте ее вымачиваться на один час при 65 °C. Извлеките подложку из стакана и промойте ее попеременно струями ацетона и изопропилового спирта. Затем высушите подложку потоком азота.

В хорошо вентилируемом вытяжном шкафу, предназначенном для работы с кислотами, приготовьте раствор Пиранья в большом чистом стакане, добавив 30% hydrogen peroxide к sulfuric acid в соотношении один к трем. Погрузите подложку после ионного травления в раствор Пиранья вытравленными элементами вверх и оставьте на пять минут. Затем извлеките подложку и тщательно промойте ее деионизированной водой.

Снова погрузите пластину в раствор Пиранья на дополнительные две минуты, а затем еще раз тщательно промойте ее большим количеством деионизированной воды. В отдельном хорошо вентилируемом вытяжном шкафу, предназначенном для работы с растворителями, промойте пластину непрерывной струей ацетона, затем непрерывной струей метанола и высушите ее струей азота. С помощью алмазного резца процарапайте на пластине прямые линии по периметру микрофлюидного чипа так, чтобы его размер был меньше размеров прямоугольного стеклянного сегмента с предварительно просверленными отверстиями.

Осторожно разломите пластину по вытравленным линиям. Промойте кремниевый сегмент непрерывной струей ацетона, а затем непрерывной струей метанола. После этого поместите пластину на нагревательную плитку при 95 °C на две минуты для высушивания.

Затем осторожно поместите чистое стекло поверх силиконового сегмента так, чтобы вытравленные элементы были обращены вверх. Убедитесь, что отверстия точно совмещены. После этого осторожно переверните сегменты, следя за тем, чтобы отверстия оставались совмещенными.

Закрепите два сегмента с помощью двусторонней токопроводящей ленты так, чтобы одна половина ленты фиксировала вертикальные края силиконового сегмента, а другая половина — выступающую часть стекла. Затем снова переверните сегменты так, чтобы стеклянный сегмент оказался сверху. Поместите сегменты на стальную пластину, установленную на нагревательном приборе при температуре 450 °C.

Затем осторожно поместите вторую стальную плиту массой не менее пяти килограммов непосредственно сверху на собранные стеклянные и кремниевые сегменты. Эта плита не должна соприкасаться с кремниевым сегментом или токопроводящей лентой. С помощью высоковольтного источника питания подключите фазный провод к стальной плите, расположенной сверху на собранных стеклянных и кремниевых сегментах, а заземление — к нижней стальной плите.

Установите напряжение на нижней нагревательной плите на уровень 1 000 вольт. Проверьте приложенное напряжение с помощью мультиметра, прижав один щуп к нижней плите, а другой — к верхней плите. Вернитесь через два часа, чтобы выключить нагревательную плиту и источник питания постоянного тока, а затем снимите устройство с металлических плит.

Соскребите поверхность стекла лезвием, чтобы удалить загрязнения, возникшие в результате анодного бондирования, а затем очистите поверхность стекла ацетоном. Далее подготовьте лист полидиметилсилоксана толщиной примерно 5 mm, вырезав из него несколько небольших квадратных пластин размером примерно 10 mm на 10 mm. С помощью биопсийного панча диаметром 3 mm проделайте по одному отверстию в центре каждой пластины.

Затем с помощью эпоксидного клея приклейте пластины непосредственно поверх отверстий на стеклянной подложке. Припаяйте два провода к двум проводящим областям преобразователя. Осторожно приклейте цирконат-титанат свинцовый преобразователь к кремниевому сегменту на задней стороне устройства, центрируя его под микроканалом.

Наконец, вставьте силиконовые трубки в отверстия в пластинах из полидиметилсилоксана и нанесите дополнительный клей вокруг пластин и трубок, чтобы зафиксировать их. Надежно закрепите устройство на предметном столике микроскопа так, чтобы микроканал находился непосредственно под объективом. Следите за тем, чтобы преобразователь не касался столика.

Затем подсоедините силиконовые трубки от выходов устройства к шприцам, закрепленным в шприцевых насосах. Поместите силиконовую трубку, ведущую к входу устройства, в виалу с суспензией полистирольных микросфер или исследуемых клеток. Затем установите виалу с образцом на магнитную мешалку для непрерывного перемешивания, чтобы обеспечить поддержание постоянной концентрации на протяжении всего эксперимента.

Подключите преобразователь к выходу усилителя мощности, соединенного последовательно с генератором функций. Задайте необходимые настройки на генераторе функций и контролируйте выходной сигнал с помощью осциллографа. Затем включите генератор функций и усилитель мощности, чтобы начать активацию преобразователя.

Затем включите микроскоп и убедитесь, что микрофлюидный канал находится в четком фокусе. Также включите шприцевой насос для ввода образца в устройство. На протяжении всего эксперимента контролируйте перемещение объектов через устройство с помощью флуоресцентного микроскопа.

В данном случае для заполнения микрофлюидной камеры суспензией зеленых флуоресцентных полистирольных микросфер использовали шприцевой насос со скоростью потока 100 µL/min. После активации цирконат-титанат-свинцового преобразователя и его настройки на частоту 2,366 MHz по ширине этого микроканала, составляющей 313 µm, формируется стоячая волна с длиной в полпериода. Это приводит к фокусировке потока микросфер вдоль узла давления.

При введении в устройство красных флуоресцентных силиконовых частиц, обладающих отрицательным коэффициентом акустического контраста, они концентрировались вдоль пучностей давления. Способность данной системы фокусировать частицы зависит как от скорости потока, так и от приложенного напряжения. При увеличении скорости потока распределение частиц по микроканалу расширяется.

Кроме того, повышение приложенного напряжения увеличивает степень фокусировки частиц. После ввода в эксплуатацию данное устройство можно использовать для манипулирования частицами и клетками в различных биоанализах на основе микрофлюидики и в экспериментах, требующих точного пространственного или временного контроля. Важно помнить о необходимости уделять достаточно времени и проявлять осторожность на каждом этапе, так как поспешность может привести к возникновению дефектов в готовом устройстве.

После изготовления устройство можно использовать многократно, при условии надлежащего ухода и очистки между использованиями с применением подходящих моющих средств и промывочных буферов. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как изготовить акустофлюидное устройство из кремния и стекла, поддерживающее объемные акустические стоячие волны. Пожалуйста, помните, что вы работаете с сильными химическими веществами, такими как раствор Пиранья, которые могут быть крайне опасны при неправильном обращении.

Пожалуйста, соблюдайте осторожность при работе с этими жидкостями, чтобы обеспечить безопасное обращение с химическими веществами во всех ваших работах по изготовлению.