Флуоресцентная Покадровый Визуализация Complete S. venezuelae Жизненный цикл Использование микрожидкостных устройств

Общая цель этого протокола флуоресцентной покадровой микроскопии состоит в том, чтобы предоставить метод изучения биологических клеточных процессов, которые лежат в основе развития и клеточной дифференцировки в спорулирующей нитевидной бактерии Streptomyces venezuelae. Описанный метод обеспечивает прекрасную платформу для изучения биологических процессов в клетках, которые занимают центральное место в жизненном цикле Streptomyces, включая динамическую локализацию белка, поляризованный рост и септацию споруляции. Основное преимущество этой методики заключается в том, что Streptomyces venezuelae спорулирует в жидкости, что позволяет выращивать клетки в микрофлюидном устройстве и микроскопически контролировать весь жизненный цикл.

Этот метод демонстрирует огромный потенциал Streptomyces venezuelae в качестве новой системы развития для рода, поскольку он позволяет визуализировать дифференцировку многоцентрового мицелия в цепочки спор в живых клетках. Для начала инокулируйте 30 миллилитров питательной среды с 10 микролитрами спор из штамма S.venezuela, который будет визуализирован. Для постоянного роста и спорообразования клеток используйте колбу с перегородкой или колбу с пружиной, обеспечивающей достаточную аэрацию.

Культивируйте клетки в течение 35-40 часов при температуре 30 градусов Цельсия и 250 оборотах в минуту. Когда все будет готово, вы сможете увидеть фрагменты мицелия и споры с помощью жидкостной фазово-контрастной микроскопии. Центрифугируйте один миллилитр культуры в настольной центрифуге при 400-кратном G в течение одной минуты, чтобы гранулировать мицелий и более крупные фрагменты клеток.

Затем переложите примерно 300 микролитров надосадочной жидкости, содержащей взвесь спор, в новую 1,5-миллиметровую трубку и поместите трубку на лед. Сохраните оставшуюся питательную среду для использования на более позднем этапе. Далее разведите споры один к 20 в добавке питательной среды, и держите разведенные споры на льду до тех пор, пока они не понадобятся.

Налейте оставшуюся питательную среду в 50-миллилитровый стакан, а затем наберите 10 миллилитров с помощью шприца и с помощью стерильного шприцевого фильтра 22 микрометра отфильтруйте оставшуюся питательную среду. Для получения отработанной добавки питательную среду не содержат спор и фрагментов мицелия. Отфильтрованную отработанную питательную среду в течение нескольких дней держите при температуре четыре градуса Цельсия, если предполагается проведение дополнительных экспериментов с использованием аналогичных условий выращивания.

Каждая микрофлюидная пластина может быть использована для проведения до четырех независимых экспериментов. Чтобы избежать загрязнения неиспользуемых проточных камер, убедитесь, что при постановке эксперимента используются стерильные растворы и условия работы. Начните с удаления транспортировочного раствора с микрофлюидной пластины.

Затем промойте лунки стерильной добавкой питательной среды. После промывки добавьте 300 микролитров добавленной питательной среды на вход в первую лунку и 300 микролитров использованной питательной среды в лунки со второй по шестую. Далее загрузите 40 микролитров разведенных спор в лунку восьмерки полосы А и запечатайте коллектор на пластине в соответствии с инструкциями производителя.

Запустите управляющее программное обеспечение микрофлюида и выберите подходящий тип пластины. Настройте программу расхода для подачи среды из входных скважин с первого по пятый при давлении шесть фунтов на квадратный дюйм в течение двух минут на лунку, чтобы заправить проточный канал и камеру для культивирования. Затем подайте добавку питательной среды под давлением шесть фунтов на квадратный дюйм во входной колодец один на шесть часов.

Это позволит произойти проращиванию и вегетативному росту. Через шесть часов программа переключится на отработанную питательную среду и подайте ее в скважины со второй по пятую при давлении шесть фунтов на квадратный дюйм до конца эксперимента. Предварительно прогрейте климатическую камеру до 30 градусов Цельсия.

Затем включите микроскоп и программное обеспечение для управления микроскопом. Установите на место масляный иммерсионный объектив с высокой числовой апертурой и убедитесь, что соответствующие фильтры и диаграммные зеркала настроены для получения дифференциально-интерференционно-контрастных изображений, а также изображений слияния желтых флуоресцентных и красных флуоресцентных белков. Капните каплю иммерсионного масла в объектив и в нижнюю часть окна визуализации на микрофлюидной пластине.

Осторожно установите герметичное микрофлюидное устройство на предметное столико инвертированного микроскопа и закрепите его на месте. Используйте встроенные маркеры положения, чтобы сфокусировать окно визуализации микрофлюидной камеры для культивирования. Сосредоточьтесь на крайней левой части первой проточной камеры, обозначенной буквой А, а затем переместите столик на пятый размер ловушки, соответствующий высоте ловушки 7 микрометров.

В микрофлюидном программном обеспечении настройте систему на нагрузку ячеек из входного отверстия 8 при давлении 4 фунта на квадратный дюйм в течение 15 секунд. После запуска процесса проверьте плотность клеток в камере для культивирования, перемещая предметный столик по окну визуализации. Если споры не были захвачены, повторите этап загрузки клеток или, в качестве альтернативы, увеличьте давление загрузки и/или время до тех пор, пока не будет достигнута желаемая плотность клеток от одной до 10 спор на окно визуализации.

Следите за тем, чтобы не перегрузить камеру для культивирования. Затем запустите заранее подготовленную программу потока в управляющем программном обеспечении и дайте микрофлюидной пластине нагреться в течение одного часа на сцене микроскопа, прежде чем начать получение изображения. В программном обеспечении для управления микроскопом настройте многомерный сбор данных для получения нескольких изображений в нескольких положениях на разных этапах в течение определенного периода времени, предварительно указав каталог для автоматического сохранения файлов изображений.

Далее переходим в настройки освещенности и вводим заранее заданные оптимальные настройки освещенности для каждого конкретного конструктива. Затем настройте временные ряды для получения изображений каждые 40 минут в течение 24 часов. Чтобы определить положение сцены и установить автофокусировку, отсканируйте камеру для культуры и сохраните позиции сцены для каждой интересующей позиции изображения.

Убедитесь, что одноступенчатые позиции расположены достаточно далеко друг от друга, чтобы свести к минимуму фотообесцвечивание и фототоксичность. После проверки Z-координат выбранных положений сцены активируйте аппаратную автофокусировку. Затем запустите покадровую съемку в программном обеспечении для управления микроскопом.

Остановите получение изображения через 24–30 часов или после того, как гифы в исследуемой области дифференцируются в споры. Затем остановите проточную программу в программном обеспечении и разберите микрофлюидное устройство. Подготовьте используемую микрофлюидную пластину к кратковременному хранению, удалив остатки среды из входных отверстий, отработанного колодца и загрузочного отверстия ячейки.

Затем заполните используемые колодцы полосы А и колодцы неиспользуемых дорожек стерильным PBS. Наконец, заклейте тарелку грушевой пленкой, чтобы предотвратить ее высыхание. И храните тарелку при температуре четыре градуса Цельсия.

Успешная визуализация всего жизненного цикла живых клеток Южной Венесуэлы дает непрерывный временной ряд, включающий ключевые этапы развития прорастания, вегетативного роста и спороношения. Во время прорастания или вегетативного роста DivIVA-mCherry накапливается исключительно на растущих кончиках гипналов или отмечает вновь формирующиеся точки ветвления гиф. В противоположность этому, FtsZ-YPet образует одиночные кольцеобразные структуры через нерегулярные промежутки времени в растущем мицелии.

Эти структуры обеспечивают каркас для синтеза неконструктивных вегетативных поперечных стенок, приводящих к образованию взаимосвязанных гифальных компартментов. В спорулирующих гифах характер локализации FtsZ-YPet резко меняется. Сначала спиральные нити FtsZ-YPet кувыркаются вдоль гифы, а затем внезапно, почти синхронно, эти спирали сливаются в лестницу из регулярно расположенных колец FtsZ-YPet.

Наконец, споруляционные перегородки становятся различимыми на дифференциально-интерференционно-контрастных изображениях, и в конечном итоге новые споры высвобождаются. Этот метод обеспечивает надежный протокол для выполнения визуализации живых клеток всего жизненного цикла Streptomyces. Микрофлюидная система проста в использовании.

Эта экспериментальная установка также предлагает отличную отправную точку для исследования конкретных событий развития в ответ на изменение культурных условий или использование флуоресцентных красителей для мониторинга синтеза пептидогликанов или для визуализации организации хромосом.