Простой биопроб для оценки факторов роста эндотелия сосудов

Общая цель этого простого клеточного биоанализа заключается в обнаружении, количественном определении и мониторинге активности лигандов семейства фактора роста эндотелия сосудов. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области биологии сосудов, вирусологии, онкологии и офтальмологии, где лиганды семейства VEGF регулируют основные процессы при данных заболеваниях. Главным преимуществом данного анализа является возможность оценки лигандов семейства VEGF с точки зрения их способности связываться и вызывать кросс-линкинг различных рецепторов без необходимости использования специализированных эпителиальных клеток.

Культивируйте секретирующую IL3 клеточную линию WEHI-3D, перенося пипеткой 5 × 10⁶ клеток в логарифмической фазе роста в 4–10 флаконов T175, содержащих 50 мл свежей культуральной среды. Инкубируйте в течение семи дней или до тех пор, пока клетки не превысят логарифмическую фазу роста примерно на 24–48 часов. Слейте жидкость с клетками из флаконов.

Центрифугируйте при 1, 000 Gs в течение 15 минут, чтобы удалить клетки и клеточный детрит. Затем снимите верхние 90% супернатанта и профильтруйте его через фильтрующий блок с порами 0.22 micron. Разлейте кондиционированную среду по аликвотам объемом один миллилитр для подготовки к анализу.

Аликвоты по 50 мл для приготовления культурной среды для пассажа фактор-зависимых клеточных линий и объемы по 200 мл для длительного хранения при 20 °C. Храните меньшие объемы при 20 °C. Культивируйте контрольные клетки BAF3 в культуральной среде, содержащей 10% кондиционированной среды WEHI-3D.

и клетки VegFR2-EPoR-BAF3 в той же среде с добавлением 1 mg/mL G418. Пересевайте клетки в разведении от 1:2 до 1:15 из культур, растущих в логарифмической фазе. Соберите контрольные клетки BAF3 или VegFR2VPoR-BAF3 из культур, находящихся в середине логарифмической фазы.

Осторожно аспирируйте клетки со дна флакона с помощью пипетки, затем центрифугируйте при 750 Gs в течение пяти минут для получения осадка клеток. Ресуспендируйте осадок в 10 миллилитрах фосфатно-солевого буферного раствора с тоничностью для мышей и повторно центрифугируйте при 750 Gs в течение пяти минут. Повторите промывку еще два раза, чтобы удалить среду, содержащую IL3.

Однократно промойте клетки средой без кондиционированной среды DEHI-3D. Важно удалить культуральную среду, содержащую IL3, чтобы исключить наличие дополнительных факторов роста, которые могут вызвать ложноположительный результат или высокий уровень фоновой активности. После центрифугирования и удаления супернатанта повторно суспендируйте клетки в той же среде без IL3 до концентрации 7,4 × 10⁴ клеток/мл.

В завершение смешайте равные объемы трипанового синего в PBS с популяцией клеток и занесите пробу в гемоцитометр. Подсчитайте не менее 100 клеток. Клетки, поглотившие краситель, считаются мертвыми или умирающими.

Крайне важно, чтобы клетки, используемые в анализе, обладали высокой жизнеспособностью, чтобы гарантировать их способность реагировать на условия анализа. Используйте хорошо откалиброванный автоматический дозатор P20 и автоклавированные наконечники, чтобы внести 1 000 клеток в 13,5 µL среды с дефицитом IL в лунки 72-луночного планшета. Тщательно перемешивайте клеточную суспензию во времяアリквотирования, чтобы исключить влияние оседания клеток под действием силы тяжести на концентрацию клеток.

С помощью хорошо откалиброванного дозатора P2 внесите по 1,5 µL среды без IL3 в три повторности в контрольные лунки. Осторожно перемешайте. Аналогичным образом внесите 10% кондиционированной среды WEHI-3D и контроль с VegFA в концентрации 100 ng/mL без IL3 в соответствующие лунки.

В завершение добавьте по 1,5 µL исследуемых образцов в трех повторностях. Заполните все неиспользуемые лунки микропланшета стерильной водой, PBS или питательной средой. Поместите смоченную водой салфетку в газопроницаемый контейнер для создания увлажненной камеры, обеспечивающей газообмен.

Инкубируйте планшеты с анализом в камерах в увлажненной атмосфере с 10% углекислого газа в течение 16 часов. После 16 часов инкубации проанализируйте планшеты с помощью стандартного инвертированного фазово-контрастного микроскопа при увеличении от 40 до 100x. На данном этапе становится возможным дифференцировать положительные и отрицательные образцы.

В лунках без факторов роста или только со средой будет наблюдаться уменьшение количества округлых клеток, а также наличие мертвых или погибающих клеток и клеточного детрита. В то же время клетки, инкубируемые в среде, содержащей IL3 или лиганд для VegFR2, будут крупными и полупрозрачными, при этом признаки гранулярности в цитоплазме клеток или наличие клеточного детрита в культуре будут минимальными или отсутствовать. Добавьте 10 000 промытых клеток в 135 µL среды, не содержащей IL3, в лунки стандартного 96-луночного планшета.

Используя откалиброванный дозатор P20, внесите по 15 µL исследуемых образцов и контролей в лунки. Инкубируйте смесь клеток, факторов роста и/или ингибирующих агентов в течение 48 часов, как описано ранее. По завершении периода инкубации определите количество жизнеспособных клеток в лунках, используя методы, изложенные в текстовой части протокола.

Здесь представлены результаты анализа, в котором биоанализ VEGF-R2 EPoR BAF3 используется для количественного определения активности трех рекомбинантных человеческих лигандов со специфичностью к VEGF-R2: VEGF-A165, VEGF-C и VEGF-D. Активность определялась в присутствии бевацизумаба, ингибирующего моноклонального антитела к VEGF-A165, или в присутствии трастузумаба, ненейтрализующего антитела.

Данные были нормализованы относительно отклика на VEGF-A165 в одиночку. Как и ожидалось, бевацизумаб блокировал эффект VEGF-A165 в анализе, но не повлиял на активность VEGF-C и VEGF-D. Клетки, подвергнутые воздействию IL3, обладали высокой жизнеспособностью.

В то время как клетки, не подвергавшиеся воздействию дополнительных факторов роста, демонстрируют низкую жизнеспособность. При выполнении данной процедуры важно помнить, что перед проведением анализа необходимо подготовить ряд контрольных агентов в кондиционированной среде. Этот метод открыл путь к возрождению исследований в области биологии сосудов, вирусологии, онкологии и офтальмологии для изучения роли VEG-FM в лигинах.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как подготовить клетки для биоанализа, провести сам биоанализ, а также выполнить количественный или полуколичественный анализ активности VEG-FM лигнина.