Эпигенетическое регуляции сердечной дифференциации эмбриональных стволовых клеток и тканей

Общая цель применения данных методов иммунопреципитации хроматина к дифференцирующимся эмбриональным стволовым клеткам или эмбриональным тканям сердца заключается в выявлении эпигенетической регуляции развития сердца. Поскольку тонкая настройка транскрипции генов в процессе развития эмбрионального сердца регулируется эпигенетическими компонентами, иммунопреципитация хроматина является подходящим подходом для понимания этого процесса.

Основным преимуществом данного метода является возможность специфического таргетирования определенного локуса и анализа эпигенетических меток, расположенных на этом конкретном участке ДНК. Данный метод позволяет получить представление об эпигенетической регуляции развития сердца. Он также может быть применен к другим органам или любым типам клеток.

Это Имен. Она аспирантка нашей лаборатории, и сегодня она проведет эксперимент. В данной процедуре используются эмбриональные стволовые клетки (ЭСК).

Эмбриоидные тельца, полученные из ЭСК, и ткани эмбрионального сердца, выделенные из эмбрионов мыши на стадии E9.5. Зафиксируйте клетки и ткани. Для клеток используйте 1% formaldehyde в PBS, а для эмбриональных тканей — буфер для пермеабилизации PB2.

Поместите пробирки на орбитальный шейкер при скорости 60 RPM при комнатной температуре ровно на 10 минут. Остановите реакцию кросс-линкинга, добавив глицин до конечной концентрации 125 millimolar, и инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре на орбитальном шейкере при скорости 60 RPM. Чтобы начать эту процедуру, ресуспендируйте осадок в 10 milliliters PBS.

Затем перенесите эмбриональные ткани в 1 ml буфера PB2. Центрифугируйте при 1000 ×g в течение пяти минут при температуре 4 °C. Удалите супернатант и добавьте соответствующий буфер для второго этапа промывки.

Добавьте ингибиторы протеаз в буферы PB1 и PB2 на льду. Добавьте один миллилитр буфера PB1 с добавлением ингибиторов протеаз к клеточному осадку и перемешайте с помощью пипетирования для ресуспендирования клеток. Аналогичным образом ресуспендируйте эмбриональные ткани в одном миллилитре буфера PB2 с добавлением ингибиторов протеаз.

После этого используйте одномиллилитровый шприц с иглой 21G для гомогенизации клеток или тканей. Перенесите клеточную суспензию в чистую пробирку объемом 1,5 мл. Инкубируйте гомогенизированные клетки и ткани при температуре 4 °C в течение 10 минут.

Центрифугируйте при 3000 ×g в течение пяти минут при температуре 4 °C. Удалите супернатант и ресуспендируйте каждый осадок в 300 µl соответствующего буфера для соникации, дополненного ингибиторами протеаз. Перенесите клеточную суспензию в сертифицированную пробирку, не содержащую РНКаз, ДНКаз и пирогенов, чтобы предотвратить деградацию ДНК, и инкубируйте от 15 до 30 минут на льду.

Для фрагментации хроматина подвергните образцы ультразвуковой обработке при температуре 4 °C, используя соответствующую программу соникации для каждого материала. Отрегулируйте продолжительность соникации в зависимости от того, будет ли ДНК использоваться для ПЦР или секвенирования. Затем центрифугируйте соникатированные клеточные лизаты в течение 10 минут.

Перенесите супернатант, содержащий растворенный хроматин из каждого образца, в чистую пробирку объемом 1,5 мл, а осадок удалите. Возьмите аликвоту каждого образца объемом 1,5 мкл и разведите ее водой в соотношении 1:10. Определите оптическую плотность всех образцов с помощью наноспектрофотометра для установления концентрации белка.

Перед проведением иммунопреципитации хроматина подготовьте бусины, конъюгированные с белком А, путем их промывки согласно описанию в тексте протокола. В чистую пробирку объемом 1,5 миллилитра добавьте антитела к модифицированным гистонам или факторам транскрипции, 20 µL промытых бусин, конъюгированных с белком А, и 1 mL буфера С с добавлением ингибиторов протеаз. Инкубируйте образцы на ротаторе при 40 RPM не менее двух часов при температуре 4 °C.

Промойте комплексы антител и бусин трижды одним миллилитром буфера C, как описано в тексте протокола. Подготовьте две пробирки: в одну поместите 150 micrograms хроматина и комплексы антител и бусин, а в другую — 150 micrograms хроматина и 20 microliters промытых бусин. Добавьте в каждую пробирку один миллилитр буфера C с добавлением ингибиторов протеаз и инкубируйте образцы на ротаторе при 40 RPM в течение ночи при температуре four degree Celsius.

По завершении ночного иммунопреципитирования поместите образцы в магнитный штатив и соберите супернатант, содержащий несвязанный антителами хроматин. Элюируйте связанный с антителами белок, добавив 150 µL буфера D1 к промытому материалу. Инкубируйте образцы в течение 20 минут при 50 °C в термоблоке.

Через 20 минут извлеките образцы из нагревательного блока и поместите их в магнитный сепаратор. Перенесите супернатант в чистую пробирку объемом 1,5 мл, а бусины удалите. Для разрыва поперечных сшивок добавьте к супернатанту 5 М NaCl до достижения конечной концентрации 200 мМ.

Подготовьте контрольный образец хроматина в чистой пробирке объемом 1,5 миллилитра. Используйте такое же количество хроматина, как и в образце для иммунопреципитации, доводя общий объем до 150 микролитров воды, свободной от РНказ и ДНказ, и 5 М NaCl до конечной концентрации 200 миллимоляр. Инкубируйте образцы в течение ночи при 65 °C.

На следующий день извлеките образцы из нагревательного блока. Добавьте ЭДТА до конечной концентрации 12.5 millimolar и протеиназу K до конечной концентрации 250 micrograms per milliliter, затем проведите расщепление при температуре 55 °C в течение двух часов. Начните выполнение данной процедуры с подготовки гранул.

Сначала выдержите гранулы при комнатной температуре в течение не менее 30 минут. Затем тщательно перемешайте гранулы на вортексе и быстро перенесите 1 мл гранул в чистую пробирку объемом 1,5 мл. Поместите пробирку с гранулами на магнит на две-три минуты до просветления раствора, после чего удалите супернатант.

Извлеките пробирку из магнита. Добавьте 1 mL 0,5 M EDTA и перемешайте кратким вортексированием. Промойте гранулы таким образом дважды и удалите супернатант после финальной промывки.

Извлеките пробирку из магнита. Добавьте 1 мл буфера E и медленно ресуспендируйте гранулы. Перенесите всю смесь в 50 мл буфера E. Поместите пробирку на шейкер и медленно перемешивайте при комнатной температуре в течение одного часа.

Затем протестируйте магнитосферные частицы для связывания ДНК, используя маркер ДНК размером 1 KB и три различных соотношения объема частиц к объему ДНК. Было установлено, что соотношение 2,5/1 является оптимальным для связывания ДНК. Для использования частиц при очистке ДНК добавьте 425 µL или 2,5 объема частиц в каждый образец ДНК и медленно ресуспендируйте, прокачав содержимое пипеткой вверх-вниз примерно 10 раз.

Инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут. Поместите на магнит на пять минут. Затем аспирируйте и удалите супернатант.

Промойте дважды свежеприготовленным 80% ethanol, добавив по 600 µL в каждую пробирку. Выждите одну минуту, затем аспирируйте и удалите супернатант. Кратковременно центрифугируйте пробирки.

Поместите пробирки на магнит. Удалите последние капли этанола и дайте им высохнуть в течение одной минуты при комнатной температуре. Снимите образец с магнита и элюируйте ДНК, добавив 20 µL воды, свободной от DNase и RNase. Перемешайте на вортексе.

Электрофорез в агарозном геле выявил размеры фрагментов ДНК, полученных после обратного сшивания всей соникационной ДНК, экстрагированной из ЭСК мыши, эмбриоидных телец и эмбриональной ткани сердца. Эксперимент по иммунопреципитации хроматина был разработан для изучения эпигенетической регуляции генов эпителиально-мезенхимального перехода в клетках дикого типа или генетически мутировавших клетках при дифференцировке ЭСК в сторону мезодермальной клеточной судьбы. Связывание модифицированных гистонов отслеживали с помощью ПЦР промоторов или энхансеров генов E-Cadherin и Twist.

Последовательное иммунопреципитирование хроматина проводилось на хроматине, экстрагированном из четырех линий эмбриональных стволовых (ЭС) клеток человека, с использованием антител к маркеру активации хроматина с последующим использованием антител к маркеру репрессии. Эти маркеры модифицируются при воздействии морфогенов на клетки, однако их состояние варьируется в зависимости от линий ЭС клеток человека. Вероятно, это обусловлено особенностями исходных бластоцист, из которых они были получены.

Метод иммунопреципитации хроматина может также применяться к хроматину, экстрагированному из специфических эмбриональных областей сердца. На этом рисунке показаны геномные области кардиальных генов Nkx2.5 и TBx5, обогащенные модифицированным гистоном, и одна геномная область специфического для водителя ритма гена Shox2, которая не обогащена и не экспрессируется в желудочке. После освоения данной методики ее выполнение занимает три часа при условии правильного соблюдения протокола.

При выполнении данной процедуры важно не забыть проверить эффективность соникации перед началом протокола IP. После завершения этой процедуры можно применить другие методы, такие как Eth-ek-se-ek, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, изучить исходное состояние хроматина (открытое или закрытое) или проанализировать расстояние между нуклеосомами. Разработка этого метода открыла исследователям в области эпигенетики возможность изучать эпигенетическую регуляцию принятия решений о судьбе клетки в любом типе клеток или эмбриональном органе.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить иммунопреципитацию хроматина.