Эпигенетическое преобразования как безопасный и простой метод получения секретирующих инсулин клеток из фибробластов кожи взрослых

Общая цель этой процедуры заключается в преобразовании фибробластов в инсулин-секретирующие клетки без индуцирования плюрипотентности или использования ретровитальных векторов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области регенеративной медицины и, в частности, в клеточной терапии сахарного диабета. Основное преимущество этого метода заключается в том, что мы можем получить переключение фенотипа без индуцирования стабильного плюрипотентного состояния в конвертирующих клетках и без ретровирусных векторов.

Демонстрировать процедуру будет Джорджия Пеннаросса, постдок в нашей лаборатории. Для начала этой процедуры добавьте в 1,5-миллиметровые чашки Петри 1,5 миллилитров стерильного 0,5% свиного желатина и дайте покрыть в течение двух часов при комнатной температуре. Затем промойте биопсию кожи человека PBS с добавлением 2% антимикотического раствора антибиотика.

После этого поместите биопсию в 100-миллиметровую чашку Петри и разрежьте ее на фрагменты примерно на два кубических миллиметра стерильными скальпелями. Затем поместите пять-шесть фрагментов кожицы в предварительно покрытую 35-миллиметровую чашку Петри. Добавьте каплю среды фибробластов на каждый фрагмент и культивируйте их при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе.

Через шесть дней после инкубации тщательно выбросьте фрагменты ткани. Фибробласты должны начать расти из фрагментов ткани и начать образовывать клеточный монослой. В этой процедуре фибробласты культивируются при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе до 80% слияния.

Затем поместите клетки в тарелки для новых культур. Культивируйте их при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе и поддерживайте соотношение прохода от одного к двум до одного к четырем, в зависимости от скорости роста. Затем добавьте 0,1% свиного желатина в чашки для клеточных культур и дайте покрыть в течение двух часов.

Излишки лакирующего раствора удалить за 10-30 минут до нанесения покрытия на фибробласты. Затем удалите питательную среду фибробластов из посуды для культивирования. Трижды промойте клетки PBS с добавлением 1% антимикотического раствора антибиотика.

Затем добавьте тонкий слой раствора Трипсин-ЭДТА. Инкубируйте его при температуре 37 градусов Цельсия до тех пор, пока монослой клеток не начнет отделяться от дна чашки для культуры тканей и клетки не диссоциируют. После этого клеточную суспензию разбавляют девятью частями питательной среды фибробластов с целью нейтрализации действия трипсина.

Затем подсчитайте клетки с помощью счетной камеры под микроскопом при комнатной температуре. Рассчитать объем питательной среды фибробластов, необходимый для ресуспендирования клеток и получения клеточной концентрации 7,8 умножить на 10 к 4-му фибробласту на квадратный сантиметр. Впоследствии суспензию клеток центрифугируют при 150 г в течение пяти минут при комнатной температуре.

Затем удаляют надосадочную жидкость и повторно суспендируют клетки рассчитанным объемом питательной среды фибробластов. После этого поместите клетки на чашки, покрытые 0,1% желатином, и культивируйте их в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе. В нулевой день, непосредственно перед применением, приготовьте стоковый раствор 5-аза-CR, растворив 2,44 миллиграмма 5-аза-CR в 10 миллилитрах среды с высоким содержанием глюкозы DMEM.

Простерилизуйте его с помощью фильтрации. Далее разведите один микролитр стокового раствора 5-аза-CR в одном миллилитре питательной среды фибробластов. Для повышения пластичности клеток через 24 часа после нанесения покрытия клеток удаляют питательную среду из засеянных фибробластов.

Добавьте один микромолярный стоковый раствор 5-аза-CR и закваливайте в течение 18 часов при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе. В первый день приготовьте свежий средний уровень HP. После инкубации с одним микромоляром 5-аза-CR удалите среду и трижды промойте клетки средой HP, чтобы убедиться, что 5-аза-CR смывается.

Затем в течение трех часов в течение трех часов в 5% углекислого газа вводят обработанные 5-aza-CR фибробласты при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе. Чтобы контролировать эффективность лечения 5-аза-CR, проверьте наличие каких-либо морфологических изменений. Клетки должны утратить типичную для фибробластов удлиненную морфологию и приобрести меньшую круглую или овальную форму с увеличенными ядрами.

С первого по шестой день приготовьте базальную среду поджелудочной железы и исходный раствор активина А. Затем культивируйте обработанные 5-aza-CR фибробласты в базальной среде поджелудочной железы с добавлением стокового раствора Activin A в течение шести дней при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе и ежедневно меняйте среду. На седьмой и восьмой дни приготовьте исходный раствор ретиноевой кислоты, добавив 16,6 миллилитров ДМСО к 50 миллиграммам ретиноевой кислоты.

Культивируйте клетки в базальной среде поджелудочной железы с добавлением стокового раствора активина А и исходного раствора ретиноевой кислоты в течение двух суток при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе и ежедневно меняйте среду. С 9-го по 36-й день культивируйте клетки и базальную среду поджелудочной железы с добавлением ITS, B27 и исходного раствора BFGS и ежедневно меняйте среду в течение первых 15 дней и обновляйте среду через день, начиная с 16-го дня. Культивируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе.

На этом рисунке показаны морфологические изменения, происходящие при эндокринной дифференцировке поджелудочной железы. После семи дней индукции клетки человека постепенно организуются в кластеры. В ответ на добавление ретиноевой кислоты они перестраиваются в сетчатый узор и группируются в различимые агрегаты.

Эти образования развиваются со временем, набирая клетки и агрегируя увеличенные 3D-колонии. Наконец, колонии становятся сферическими структурами, которые имеют тенденцию отделяться и свободно протекать в культуральной среде, напоминая типичные островки поджелудочной железы in vitro. После 36 дней индукции поджелудочной железы глобальные уровни метилирования ДНК эпигенетически преобразованных клеток человека вернулись к уровню, наблюдаемому в необработанных фибробластах.

Ко-локализация PDX1 с CPEP наблюдается в конце конверсионного периода, в то время как эти эндокринные маркеры поджелудочной железы полностью отсутствуют в необработанных фибробластах. Этот график показывает количество высвобождения инсулина из эпигенетически преобразованных клеток в ответ на воздействие 20 миллимолярной D-глюкозы и 20 миллимолярной L-глюкозы. После освоения этой техники ее можно выполнить за 38 дней, если она выполнена правильно.

После своего развития это исследование проложило путь для исследователей в области регенеративной медицины к изучению клеточной терапии диабета у человека. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как преобразовать фибробласты в инсулин-секретирующие клетки, не индуцируя плюрипотентность и не используя ретровирусные векторы.