Мышиной модели кишечная ишемия-реперфузии

Общей целью этой процедуры является выполнение воспроизводимого повреждения, вызванного ишемией ишемии кишечника, в области мышиного отделения путем временной окклюзии периферических и терминальных коллатеральных ветвей верхней брыжеечной артерии. Этот метод может помочь понять основные методы в области гастроэнтерологии и иммунологии, такие как понимание механизма повреждения и регенерации надколенника. Преимущество этой методики заключается в том, что она может быть выполнена любым обученным человеком в лаборатории.

Еще одним преимуществом является то, что сама процедура не приводит к смертности мышей. Подготовьте место операции, как указано в текстовом протоколе. Затем с помощью хирургических ножниц сделайте лапаротомию от трех до пяти сантиметров средней линии.

Затем накройте операционную область стерильной неадгезивной подушечкой, смоченной в физрастворе. Изолируйте слепую кишку и подвздошную кишку и используйте ватные тампоны, смоченные солевым раствором, чтобы обнажить верхнюю брыжеечную артерию. Затем, чтобы облегчить наложение клипсы, используйте нагружающие щипцы, чтобы осторожно поднять кишечник, и найдите ножницы радужной оболочки, чтобы разрезать брыжеечную артерию с обеих сторон верхней брыжеечной артерии в желаемом положении клипа.

Удерживая кишечник в поднятом положении, другой рукой осторожно сожмите аппликатор клипсы, чтобы открыть челюсти высококачественного зажима для микрососудистых сосудов 70 G-Force. Затем расположите зажим на сосуде, и аккуратно отпустите губки, закупоривая сосуд. Таким же образом установите еще один-два микрососудистых зажима до тех пор, пока в результате окклюзии ветвей верхней брыжеечной артерии первого порядка не образуется пяти-семисантиметровая область ишемизированной подвздошной кости, прилегающая к слепой кишке.

Теперь поместите два микрососудистых зажима 40 G-Force поперек кишечника, чтобы блокировать коллатеральный кровоток и обозначить ишемизированную область кишечника. Когда все зажимы будут на месте, нанесите на операционную область стерильную деликатную салфетку, смоченную физиологическим раствором 37 градусов Цельсия, и поддерживайте ишемию в течение 60 минут под тщательным контролем. Если процедура ишемии была выполнена правильно, область изменится на винно-красный цвет примерно через 30 минут, а кровеносные сосуды дистальнее положения клипсы станут увеличенными, что указывает на успешную окклюзию.

В конце ишемии отметьте края ишемизированной области десятью микролитрами гематоксилина Гилла, чтобы облегчить забор ишемизированного и прилегающих здоровых тканей. В конце ишемии добавьте несколько капель физиологического раствора в область клипсы и аккуратно удалите микрососудистые клипсы с помощью клипсы-аппликатора. Затем аккуратно протолкните кишечник обратно в брюшную полость с помощью смоченных солевым раствором ватных наконечников.

Снимите неадгезивную подушечку и закройте брюшную стенку и кожу девятимиллиметровыми нержавеющими зажимами для ран. Поддерживайте животных в отапливаемой, чистой клетке в течение желаемого периода реперфузии, проверяя мышей каждые 30 минут, чтобы подтвердить их устойчивость. По окончании реперфузии усыпить мышь, вскрыть брюшную полость и собрать ишемизированные и прилегающие здоровые нормальные ткани.

Далее с помощью шприца объемом 30 миллилитров, оснащенного иглой для зондажа, наполненной физиологическим раствором, вымывают содержимое кишечника, а затем разрезают кишечник в продольном направлении. Если для экспресс-анализа генов требуется образец кишечника, зарезервируйте продольный фрагмент размером от одной целой пяти до двух миллиметров. Для гистологического анализа с помощью пары щипцов сверните кишку в швейцарский рулон и поместите кусочки интенсива между подушечками из пенопласта для биопсии в кассету.

Наконец, поместите кассеты в десятипроцентный буферизованный формалин для фиксации ишемизированных и здоровых тканей кишечника. Здесь показана репрезентативная тканевая кассета, содержащая швейцарские булочки, приготовленные из контроля, и ишемизированные участки подвздошной кости после одного часа ишемии и одного часа реперфузии. Обратите внимание на разницу в цвете между контрольной и ишемизированной тканями.

Также был включен кусочек селезенки для облегчения позиционирования контрольной и ишемической реперфузионной кишки во время обработки и окрашивания. На этих изображениях показано репрезентативное окрашивание гематоксилином и эозином контроля, а также ишемические области подвздошной кости после одного часа ишемии или одного часа ишемии с последующей двухчасовой реперфузией. Обратите внимание на серьезное повреждение эпителия, наблюдаемое после одного часа ишемии, характеризующееся геморрагическими ворсинками, оголением эпителия с частичной или полной абляцией crips и инфильтрацией иммунных клеток.

После двухчасовой реперфузии повреждение ВИЛИГ и воспаление сохраняются, но кровоизлияния в ткани не происходит. Анализ экспрессии воспалительного синитуса через 1 и 2 часа после ишемической реперфузии в ишемизированном и контрольном кишечнике демонстрирует повышение регуляции в ФНО альфа, ИЛ один бета, ИЛ шесть сидеацина, а также увеличение экспрессии мРНК Cxcl 2 хемокина в обоих условиях ишемической реперфузии по сравнению с контрольной здоровой тканью. Как только вы освоите эту технику, ее можно выполнить за три с половиной часа, чтобы выполнить ее должным образом.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выполнять воспроизводимое реперфузионное повреждение при ишемии кишечника.