Идентификация критических условий для Иммуноокрашивание в гороховой тли эмбрионов: Повышение проницаемости тканей и уменьшения фонового окрашивания

Общей целью этого протокола иммуноокрашивания является обнаружение экспрессии белка в эмбрионах тли. Выявлены критические условия, повышающие проницаемость тканей и снижающие фоновое окрашивание, что является давними проблемами при окрашивании эмбриональных тканей тли. Основное преимущество данной методики заключается в том, что она обеспечивает определенные условия для эффективного проникновения антител и снижения фонового окрашивания, которые обычно не описываются в стандартном протоколе иммуноокрашивания.

Впервые у нас появилась идея об этой мере, когда мы изучали, как геномные и экологические исследования специфицируются в моделях насекомых гороховой тли. Лабораторный штамм гороховой тли, a. pisum, был первоначально собран в центральной части Тайваня и выращивался на растениях-хозяевах на протяжении более 300 поколений.

Чтобы прорасти, замочите семена растений-хозяев в водопроводной воде на три-пять дней при комнатной температуре. Пополняйте запас свежей воды один раз в день. Вырастите десять прорастающих семян в небольшом горшке с почвой в камере роста под фотопериодом 16 часов светом, восемь часов в темноте, при температуре 20 градусов по Цельсию.

Примерно через 10 дней после начала роста высота растений обычно составляет более восьми сантиметров. Держите каждый горшок с растениями в стеклянном стакане объемом один литр и перенесите взрослых тлей на растения с помощью кисти. Затем закройте стакан воздухопроницаемой крышкой, например, марлевой сеткой, чтобы предотвратить побег тли.

Инкубируйте тлю в камере роста при 16 часах света и 8 часов в темноте, при температуре 20 градусов Цельсия, поливая каждый горшок с растениями один раз в день. Заполните одну лунку точечной пластины примерно 500 микролитрами 4-процентного параформальдегида. Поместите пластину под стереомикроскоп при малом увеличении и погрузите взрослую тлю в параформальдегид для вскрытия.

Рассеките яичники, удерживая головку и брюшную полость одним набором щипцов, разрезая тыльную кутикулу брюшной полости и оттягивая яичники от брюшной полости. Далее зафиксируйте три пары яичников в 1,5-миллилитровой пробирке, содержащей один миллилитр параформальдегида комнатной температуры, на 20 минут, при легком встряхивании на миксере. Выбросьте фиксирующий буфер стеклянной пипеткой, а затем промойте яичники PBST трижды в течение 10 минут, слегка встряхивая.

Для лечения яичников сначала инкубируйте их с Протеиназой К в течение 10 минут с легким встряхиванием для повышения проницаемости эмбриональных тканей. После инкубации выбросьте раствор протеиназы К, а затем промойте яичники 700 микролитрами глицина три раза в течение пяти минут. Далее промойте яичники PBST дважды в течение 10 минут.

Снова зафиксировать яичники с помощью фиксирующего буфера на 15 минут при комнатной температуре с легким встряхиванием. Для подавления активности энгоенозной пероксидазы следует последовательно обезвоживать яичники различными процентами метанола в 0,2% PBST с объемным соотношением один к трем, один к одному и три к одному, а затем дополнительно инкубировать яичники со 100% метанолом в течение одного часа при комнатной температуре с легким встряхиванием. Затем последовательно регидратируйте яичники, как указано в текстовом протоколе.

Для трех пар яичников в пробирке объемом 1,5 миллилитра 200 микролитров – это минимальный объем для блокировки образца и окрашивания антителами. Инкубируйте яичники с помощью блокирующего раствора 1x DIG-B в течение четырех часов при комнатной температуре или в течение ночи при четырех градусах Цельсия, с легким встряхиванием. После инкубации выбросьте надосадочную жидкость и замените ее свежим 1x блокирующим раствором DIG-B, содержащим первичное антитело в соответствующем соотношении разведения.

Окрашивайте яичники в течение четырех часов при комнатной температуре, или на ночь при четырех градусах Цельсия с легким встряхиванием. После промывания яичников, как описано в текстовом протоколе, выбросьте надосадочную жидкость и замените ее свежим блокирующим раствором 1x DIG-B, содержащим вторичное антитело в соответствующем соотношении разведения, и окрашивайте яичники, как и раньше. Для иммунофлуоресцентного окрашивания проводите окрашивание в темное время суток, потому что вторичное антитело чувствительно к свету.

Толщина зародышей тли варьируется в зависимости от стадии развития. Таким образом, стратегии посадки модифицируются для ранних, средних и поздних эмбрионов. Перенесите яичники вместе с монтажной средой в клеточный лоток с помощью пластиковой пипетки и рассматривайте образцы под стереомикроскопом при малом увеличении.

Отрежьте мозоли, связанные с боковым яйцеводом, с помощью булавок от насекомых, а затем перенесите изолированный овариол в пустую стеклянную лунку с помощью капельницы. Доведите окончательный объем до 50-100 микролитров с помощью монтажного материала. Затем перенесите овариол на предметное стекло с помощью стеклянной пипетки.

Препарируйте яйцевые камеры с помощью булавок от насекомых. Для эмбрионов старше шестой стадии развития рекомендуется разделение яйцевых камер. Для гермарии и первых двух яйцевых камер сепарация необязательна.

Переместите рассеченную яйцевую камеру на чистое предметное стекло с помощью стеклянной пипетки. Для эмбрионов на стадии с первой по 10 стадию развития медленно наденьте покровную салфетку на рассеченные гермарии или яйцевые камеры, чтобы избежать образования пузырьков. В качестве альтернативы, для эмбрионов на стадии с 11 по 18 стадию развития, установите камеры для яиц на предметное стекло с односторонним перемычкой крышки и поместите еще одну крышку поверх образца.

Для эмбрионов старше 19 стадии развития установите камеры для яиц на предметное стекло с двусторонним перемычкой-крышкой, а сверху на образец поместите еще одну защитную крышку. Затем заполните пространство под верхним защитным стеклом монтажным материалом, чтобы избежать высыхания образца. Слегка сверните верхнюю крышку, чтобы получить правильную ориентацию для наблюдения.

Наконец, перед выполнением анализа изображения заклейте края защитных пластинок, включая покровные пластинки моста, лаком для ногтей, как описано в текстовом протоколе. Здесь показана пара яичников, рассеченных у взрослой женщины. Овариол состоит из одного гермариума, одного-двух О-сайтов и пяти-семи эмбрионов, все из которых размещаются в яйцевых камерах по типу сборочной линии.

После фиксации параформальдегида настоятельно рекомендуется переваривание яичников в растворе Протеиназы К в концентрации один микрограмм на миллилитр в течение 10 минут. Результаты окрашивания показывают, что интенсивность сигнала значительно увеличивается у переваренных эмбрионов потейназы К. Инкубация эмбрионов в блокирующем растворе из буферного набора на основе DIG снижает фоновое окрашивание в большей степени, чем у эмбрионов в нормальной козьей сыворотке и бычьем сывороточном альбумине.

Эндогенная активность пероксидазы также может приводить к высокому фоновому окрашиванию. Эти исследования показывают, что погружение эмбрионов тли в метанол может подавить активность пероксидазы гораздо эффективнее, чем обработка эмбрионов перекисью водорода. Критические условия, выявленные в этом исследовании, могут быть применены для обнаружения сигналов как в половых клетках, так и в соматических клетках.

После освоения этой техники ее можно сделать за два дня, если она выполнена правильно. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить успешное иммуноокрашивание эмбрионов тли, включая повышение интенсивности сигнала и снижение фонового окрашивания. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что нужно аккуратно манипулировать каждым эмбрионом, чтобы получить хорошую форму эмбрионов.

Не забывайте, что работа с параформальдегидом и DAPI может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как перчатки. После этой процедуры могут быть выполнены другие меры, такие как гибридизация in situ, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, локализуется ли РНК мессангера вместе со своим белковым продуктом в эмбриональных клетках. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии окружающей среды насекомых, например, как определяются зародышевые клетки и как яйцеклетки определяются в различных репродуктивных фазах у тлей.