Идентификация критических условий для Иммуноокрашивание в гороховой тли эмбрионов: Повышение проницаемости тканей и уменьшения фонового окрашивания

Общая цель данного протокола иммуноокрашивания заключается в выявлении экспрессии белков в эмбрионах тли. Определены критические условия, которые повышают проницаемость тканей и снижают фоновое окрашивание, что является давней проблемой при окрашивании эмбриональных тканей тлей. Основным преимуществом данного метода является обеспечение специфических условий для эффективного проникновения антител и уменьшения фонового окрашивания, которые обычно не описываются в стандартных протоколах иммуноокрашивания.

Впервые идея этого метода анализа возникла у нас при изучении спецификации зародышевых клеток у гороховой тли — одного из модельных насекомых для геномных и экологических исследований. Лабораторный штамм гороховой тли, A. pisum, был первоначально собран в центральном Тайване и разводится на растениях-хозяевах на протяжении более 300 поколений.

Для проращивания замочите семена растений-хозяев в водопроводной воде на три-пять дней при комнатной температуре. Обновляйте воду один раз в день. Вырастите десять проросших семян в небольшом горшке с почвой в камере выращивания при фотопериоде 16 часов света и 8 часов темноты при температуре 20 °C.

Примерно через 10 дней после начала роста высота растений обычно превышает восемь сантиметров. Поместите каждый горшок с растениями в стеклянный стакан объемом 1 л и перенесите взрослых тлей на растения с помощью кисти. Затем закройте стакан воздухопроницаемой крышкой, например, марлевой сеткой, чтобы предотвратить побег тлей.

Инкубируйте тлей в климатической камере при фотопериоде 16 часов света и 8 часов темноты при температуре 20 °C, поливая каждый горшок с растениями один раз в день. Наполните одну лунку планшета примерно 500 µL 4% параформальдегида. Поместите планшет под стереомикроскоп с малым увеличением и погрузите взрослую тлю в параформальдегид для последующего препарирования.

Проведите диссекцию яичников: зафиксируйте голову и брюшко одним пинцетом, разрежьте дорсальную кутикулу брюшка и аккуратно извлеките яичники из брюшной полости. Затем поместите три пары яичников в пробирку объемом 1,5 миллилитра, содержащую один миллилитр параформальдегида, и зафиксируйте при комнатной температуре в течение 20 минут при легком перемешивании на миксере. Удалите фиксирующий буфер с помощью стеклянной пипетки, после чего трижды промойте яичники в PBST по 10 минут при легком перемешивании.

Для обработки яичников сначала инкубируйте их с Proteinase K в течение 10 минут при легком встряхивании для повышения проницаемости эмбриональных тканей. После инкубации удалите раствор Proteinase K, затем трижды промойте яичники 700 µL глицина по пять минут. Затем дважды промойте яичники в PBST по 10 минут.

Снова зафиксируйте яичники в фиксирующем буфере в течение 15 минут при комнатной температуре при легком встряхивании. Чтобы подавить активность эндогенной пероксидазы, проведите последовательное обезвоживание яичников метанолом различных концентраций в 0,2% PBST с объемным соотношением один к трем, один к одному и три к одному, после чего инкубируйте яичники в 100% метаноле в течение одного часа при комнатной температуре при легком встряхивании. Затем проведите последовательную регидратацию яичников согласно инструкциям в текстовом протоколе.

Для трех пар яичников в пробирке объемом 1,5 мл минимальный объем для блокировки образцов и окрашивания антителами составляет 200 мкл. Инкубируйте яичники с 1x блокирующим раствором DIG-B в течение четырех часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4 °C при легком встряхивании. После инкубации удалите супернатант и замените его свежим 1x блокирующим раствором DIG-B, содержащим первичные антитела в соответствующем коэффициенте разведения.

Проводите окрашивание яичников в течение четырех часов при комнатной температуре или в течение ночи при температуре 4 °C при слабом встряхивании. После промывки яичников, как описано в текстовом протоколе, удалите супернатант и замените его свежим 1x блокирующим раствором DIG-B, содержащим вторичные антитела в соответствующем соотношении разведения, и повторите окрашивание яичников, как указано ранее. При иммунофлуоресцентном окрашивании проводите процедуру в темноте, так как вторичные антитела чувствительны к свету.

Толщина эмбрионов тли варьируется в зависимости от стадии развития. Поэтому стратегии монтирования модифицируются в соответствии с ранними, средними и поздними стадиями развития эмбрионов. Перенесите яичники вместе со средой монтирования в кювету с помощью пластикового пипеточного дозатора и осмотрите образцы под стереомикроскопом при малом увеличении.

Отрежьте мозолистые образования, связанные с латеральным яйцеводом, используя энтомологические булавки, затем перенесите отдельный овариол в пустую стеклянную лунку с помощью пипетки. Доведите конечный объем до 50–100 µL, используя среду для заключения. Затем перенесите овариол на предметное стекло стеклянной пипеткой.

Препарируйте яйцевые камеры с помощью энтомологических булавок. Для эмбрионов старше шестой стадии развития рекомендуется разделение яйцевых камер. Для гермариев и первых двух яйцевых камер разделение является необязательным.

Перенесите препарированную яйцевую камеру на чистый предметное стекло с помощью стеклянного пипеточного дозатора. Для эмбрионов на стадиях развития с 1 по 10 медленно накройте препарированные гермарии или яйцевые камеры покровным стеклом, чтобы избежать появления пузырьков воздуха. В качестве альтернативы, для эмбрионов на стадиях развития с 11 по 18 закрепите яйцевые камеры на предметном стекле с использованием одностороннего «мостика» из покровного стекла, а затем поместите еще одно покровное стекло поверх образца.

Для эмбрионов, достигших стадии развития более 19, зафиксируйте яйцевые камеры на предметном стекле с помощью двустороннего мостика из покровных стекол, затем накройте образец еще одним покровным стеклом. Далее заполните пространство под верхним покровным стеклом фиксирующей средой, чтобы предотвратить высыхание образца. Осторожно перекатите верхнее покровное стекло, чтобы добиться правильной ориентации для наблюдения.

Наконец, перед проведением анализа изображений герметизируйте края покровных стекол, включая покровные стекла-мостики, с помощью лака для ногтей, как описано в текстовом протоколе. Здесь показана пара яичников, выделенных из взрослой самки. Овариола состоит из одного гермария, одного или двух участков ооцитов (O-sites), а также пяти–семи эмбрионов, которые располагаются в яйцевых камерах по принципу конвейера.

После фиксации параформальдегидом настоятельно рекомендуется провести переваривание яичников в растворе протеиназы K в концентрации 1 µg/mL в течение 10 минут. Результаты окрашивания показывают, что интенсивность сигнала значительно возрастает в эмбрионах, подвергнутых воздействию протеиназы K. Инкубация эмбрионов в блокирующем растворе из набора буферов для DIG-метилирования более эффективно снижает фоновое окрашивание, чем инкубация эмбрионов в нормальной сыворотке козы или бычьем сывороточном альбумине.

Эндогенная активность пероксидазы также может приводить к высокому фоновому окрашиванию. Данные исследования показывают, что погружение эмбрионов тлей в метанол подавляет активность пероксидазы гораздо эффективнее, чем обработка эмбрионов перекисью водорода. Критические условия, выявленные в этом исследовании, могут быть применены для детекции сигнала как в зародышевых, так и в соматических клетках.

После освоения данной методики ее выполнение при правильном подходе может занять два дня. После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как успешно провести иммуноокрашивание эмбрионов тлей, включая способы повышения интенсивности сигнала и снижения фонового окрашивания. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости бережного обращения с каждым эмбрионом для сохранения их правильной формы.

Не забывайте, что работа с параформальдегидом и DAPI может быть крайне опасной, поэтому при выполнении данной процедуры следует всегда соблюдать меры предосторожности, например, использовать перчатки. После выполнения данной процедуры можно провести другие исследования, такие как гибридизация in situ, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, локализована ли матричная РНК вместе со своим белковым продуктом в эмбриональных клетках. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области экологической биологии насекомых, такие как механизмы спецификации зародышевых клеток и определение яйцеклеток на разных репродуктивных фазах у тлей.