Создание рака стволовых клеточных культур от человека обычного остеосаркомы

Общая цель этого эссе состоит в том, чтобы выделить раковые стволовые клетки из конечной клеточной линии, полученной из остеосаркомы человека. Основное преимущество этой работы заключается в том, что она наглядно показывает другим специалистам в области онкологии, как выделять in vitro раковые стволовые клетки. Эти клетки затем могут быть использованы для исследования методов лечения остеосаркомы и других солидных опухолей.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим вопросом, будут испытывать трудности, если они не знают, как изолировать колонии саркомы. Визуальная демонстрация этого имеет решающее значение, так как этап изоляции трудно осознать и понять. Впервые идея этой техники пришла нам в голову, когда мы прочитали эссе о формировании сферы.

Описание от Гипса и соавторов. Демонстрировать процедуру будут доктор Гайя Палмини, аспирант, и доктор Роберто Зонефрати, техник из моей лаборатории. Для начала подготовьте всю необходимую питательную среду.

Пищеварительные буферы и другие растворы, которые понадобятся для проведения процедуры. Затем установите конечноклеточную линию остеосаркомы, выделив остеосаркому из подтвержденной иглы или хирургической биопсии. И субкультивирование полученных клеток так, как описано в сопроводительной текстовой статье.

После того, как культура клеток остеосаркомы была установлена, и пластина близка к слиянию. Удалите среду с помощью аспирации и трипсинизируйте клетки, чтобы освободить их от пластины. Переложите клетки в свежую пробирку и аккуратно пипетируйте клеточную суспензию вверх и вниз, чтобы рассеять любые клеточные комки.

Далее соберите десять микролитров клеточной суспензии, и перенесите ее в камеру гемоцитометра. Поместите камеру гемоцитометра под фазово-контрастный микроскоп и рассчитайте концентрацию клеток в суспензии. Затем добавьте 280 000 клеток к 35 миллилитрам среды для выращивания саркосферы, содержащей метоцеллюлозу, и аккуратно перемешайте раствор с помощью пипетки, чтобы разогнать любые комки.

Перелейте по пять миллилитров клеточной смеси в каждую лунку из шести лунок со сверхнизким уровнем прикрепления. После нанесения покрытия используйте инвертированный микроскоп, чтобы наблюдать, как выглядят клетки и хорошо ли они изолированы. Инкубируйте клетки в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия и пятипроцентным углекислым газом.

Каждые три дня добавляйте в каждую лунку свежие спиртаты бета FGF и EGF, чтобы освежить концентрацию факторов роста. Изучите ход анализа саркосферы, рассматривая клетки под микроскопом через 7, 14, 20, 21 и 28 дней. Когда вы наблюдаете наличие больших черных саркосфер, которые все вместе находятся в центре скважины, прекращается культивирование и начинается процесс запустения.

Когда придет время изолировать саркосферу, используйте стерильную пипетку объемом 1000 микролитров, чтобы перенести среду, содержащую саркосферы, в шприц со стерильным мембранным фильтродержателем. После полного удаления среды, содержащей саркосферы, добавьте в лунку пять миллилитров питательной среды, и промойте ее для уверенности. И соберите все оставшиеся сферы.

Затем с помощью микроскопа подтвердите, все ли саркосферы были восстановлены. Если нет, промойте колодец еще раз до тех пор, пока сбор сфер не будет завершен. Затем отфильтруйте суспензию через держатель мембранного фильтра под действием силы тяжести, чтобы не повредить сферы и убедиться, что саркосферы не проходят через фильтр.

Во время этого процесса удалите все пузырьки воздуха с помощью стерильной стеклянной пипетки. После того, как все саркосферы будут отфильтрованы, промойте фильтрационную установку, добавив десять миллилитров питательной среды непосредственно в шприц и дав ей отфильтровать без давления, чтобы убедиться, что отдельные клетки удалены. После того, как суспензия саркосфер была отфильтрована, необходимо отбросить фильтр жидкости и уделить серьезное внимание восстановлению саркосфер, которые запутались в сетчатом фильтре.

В этот момент возьмите часть фильтрующего блока, вынув его из шприца. И поместите его в 100-миллиметровую чашку Петри. Снимите сетчатый фильтр с держателя мембранного фильтра с помощью стерильного пинцета.

И переложите фильтр на новую 60-миллиметровую чашку Петри. Затем промойте сетчатый фильтр, слегка встряхнув его. При этом добавляется пять миллилитров питательной среды, для того чтобы освободить саркосферы от клубка мембраны.

Затем поместите мембрану в лунку и подтвердите с помощью микроскопического наблюдения, что в мембране больше нет сфер, запутавшихся в ней. Снова промойте мембрану, а затем еще раз проверьте мембрану под микроскопом, есть ли еще запутавшиеся в мембране сферы. Когда в мембране больше не останется сфер, инкубируйте их в питательной среде, чтобы вырастить саркосферы в монослой.

Следите за ростом стволовых клеток рака остеосаркомы, которые получают из саркосфер. До тех пор, пока клетки не достигнут примерно 90% конфлюенции, в 60-миллиметровой чашке Петри. В дополнение к многочисленным постоянным протоколам, найденным в этой статье, методы оценки дифференцировочной способности, активности ALDH, проточной цитометрии, иммунофлоресценции и анализа ОТПЦР подробно включены в сопроводительный текстовый протокол.

Образцы остеосаркомы получают путем игольчатой аспирации или хирургического пересечения. И при правильном подходе требуется примерно один месяц, чтобы первичные культуры достигли слияния в 100-миллиметровой чашке Петри. После расширения ячейки помещаются в шесть лунок со сверхнизким уровнем прикрепления, чтобы начать анализ саркосферы.

Эта пластина поддерживает клетки в подвешенном состоянии и предотвращает прикрепление субстрата. Через семь дней наблюдается несколько небольших сферических колоний, окруженных одиночными клетками. А через 28 дней наблюдается несколько крупных саркосфер.

После того, как сферические колонии изолированы, стволовые раковые клетки могут быть расширены из отдельных саркосфер, поместив их на нормальные пластины прикрепления. Иммунофлуоресцентное окрашивание показало фенотип, подобный мезенхимальным стволовым клеткам, поскольку расширенные клетки были положительными на CD44 для CD105 и умеренно положительными для Stro-1. RTPCR также положительно показал фенотип эмбриональных стволовых клеток по экспрессии трех маркерных генов эмбриональных стволовых клеток.

Nanog, 3/4 октября, и Sox2. И ген CD133, маркер стволовых клеток рака остеосаркомы. Детально описанная техника выделения, которую мы показали в этом видео, проложит путь другим исследователям к изучению раковых стволовых клеток, показав им, как понимать и воспроизводить наиболее важные этапы анализа формирования сфер.

Эти модифицированные анализы являются хорошим методом для выделения раковых стволовых клеток и изучения их биологии. Это вещество, с дополнительными адаптациями, также может быть использовано для выделения раковых стволовых клеток из других конечных линий раковых клеток. Получают путем биопсии солидных опухолей.

В заключение следует отметить, что выделение раковых стволовых клеток из нескольких типов опухолей позволит изучить их биологию. С конечной целью поиска молекулярных мишеней и разработки очень специфических противораковых терапий, направленных против определенных клеточных подмножеств.