Выделение и дифференциация полученных из жировой ткани стволовые клетки из свиных подкожного жирового ТКАНЕЙ

Общая цель данной процедуры заключается в выделении стволовых клеток из жировой ткани свиней из подкожного белого жира для оценки их способности дифференцироваться в мезенхимальные адипоциты, остеоциты и хондроциты. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы исследований ожирения. Он представляет собой эффективный инструмент для раскрытия молекулярных механизмов, участвующих в регуляции развития жировой ткани.

Основным преимуществом данного метода является возможность получения большого количества стромаваскулярных клеток, что позволяет проводить углубленный анализ дифференцировки и биологии адипоцитов. Значение этой методики заключается в исследованиях терапии стволовыми клетками, так как стволовые клетки, полученные из жировой ткани свиньи, обладают мультипотентностью и способны к трансдифференцировке в несколько клеточных линий. Начните с того, что положите поросенка в положении на животе на чистый операционный стол.

Сбрите всю шерсть по срединной линии от шеи до хвоста и трижды обработайте кожу спины 7,5% раствором повидон-йода. После третьей обработки оставьте йод на поверхности кожи примерно на 10 минут. Затем распрыскайте на кожу 70% этанол.

Используйте смоченные в этаноле марлевые салфетки, чтобы протереть кожу в одном направлении до полного удаления антисептика, пока не исчезнет видимый цветовой след. Затем сделайте разрез от области шеи вниз к ноге. После этого, приподняв жир и кожу пинцетом, с помощью скальпеля отделите слой спинного подкожного жира свиньи и прилегающий слой кожи от мышц.

Немедленно погрузите ткани кожи и жировой ткани в стерильный стакан объемом 200 мл, содержащий DMEM без сыворотки при температуре 37 °C, и обработайте внешнюю поверхность стакана 70% этанолом. Затем поместите стакан в ламинарный шкаф для культивирования клеток и положите рядом со стаканом стерильный трехслойный слой фольги размером 40 на 30 см. Перенесите ткань на фольгу кожей вниз.

Используя пинцет и ножницы, удалите остатки мышечной ткани из жировой ткани. Разрежьте жир на квадратные кусочки размером 7 на 7 сантиметров, а затем перенесите их в новый стерильный стакан объемом 200 мл, содержащий безсывороточную среду DMEM при температуре 37 °C. Теперь установите специальный держатель для срезов, оснащенный лезвием из углеродистой стали, на защитную фольгу и поместите один из кусочков жира на срезчик жировым слоем вниз.

Нарежьте жировую ткань ломтиками толщиной примерно 1 мм, максимально близко к коже, но не прорезая её. Затем с помощью ножниц максимально мелко измельчите кусочки жировой ткани и перенесите их в колбу Эрленмейера объемом 250 мл, содержащую отфильтрованную среду для переваривания с добавлением коллагеназы. Инкубируйте колбу при перемешивании в течение 90 минут при 45 об/мин на орбитальном шейкере при 37 °C.

Когда пищевая среда станет однородной суспензией без крупных комков ткани, остановите процесс переваривания, добавив равный объем культуральной среды DMEM F-12 с 10% FBS. Чтобы собрать мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани свиньи, профильтруйте суспензию переваренной жировой ткани через один слой шифона в стерильный серологический флакон объемом 250 мл, используя пинцет для прижимания центра шифона, чтобы направить и облегчить прохождение дигестата. Откиньте и выжмите шифон с помощью пинцета, чтобы полностью завершить фильтрацию, и распределите среду по четырем коническим центрифужных пробиркам объемом 50 мл.

Соберите стромально-васкулярные клетки путем центрифугирования. Затем слейте супернатант, не затрагивая осадок, чтобы удалить большую часть верхнего жирового слоя, содержащего зрелые адипоциты. После этого повторно суспендируйте осадок в 10 milliliters DMEM с помощью пипетирования и осторожного встряхивания.

Снова центрифугируйте клетки и ресуспендируйте осадки в 10 миллилитрах буфера для лизиса ACK. После семи минут выдержки при комнатной температуре остановите лизис эритроцитов, добавив по 10 миллилитров DMEM в каждую пробирку, и осторожно встряхните пробирки для перемешивания. Затем снова центрифугируйте клетки.

Промойте клетки еще дважды 10 миллилитрами DMEM, затем объедините супернатанты, профильтруя их через сито с размером пор 100 микрон, в одну коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Осторожно несколько раз перемешайте клеточную суспензию с помощью пипетки для равномерного распределения клеток и подсчитайте количество клеток методом исключения трипанового синего. В завершение высейте мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани свиньи с плотностью 6 × 10⁴ на см² в подходящий по размеру контейнер для культивирования с питательной средой для культур клеток.

Инкубируйте клетки при 37 °C и 5% CO2 для обеспечения формирования монослоя. Морфология свиных мезенхимальных стволовых клеток, полученных из стромально-васкулярной фракции жировой ткани, схожа с морфологией стволовых клеток жировой ткани мыши или человека: через 24 часа после посева наблюдается расширенная фибробластоподобная морфология. Свиные стволовые клетки жировой ткани достигают конфлюэнтности в течение 72 часов, после чего они готовы к дифференцировке в адипоциты или другие клетки мезенхимального типа.

Эти клетки также проявляют выраженный адипогенный потенциал после химической индукции; через девять дней дифференцировки наблюдаются зрелые адипоциты, при этом более 90% стволовых клеток жировой ткани свиньи демонстрируют адипогенную дифференцировку. Поверхностные маркеры мезенхимальных стволовых клеток, включая CD 29, CD 44, CD 90 и MHC 1, высоко экспрессированы на стволовых клетках жировой ткани свиньи, в то время как CD 4a, CD 31, CD 45 и MHC II практически не обнаруживаются, что доказывает наличие у этих клеток характеристик мезенхимального типа без значительного загрязнения эндотелиальными или гемопоэтическими стволовыми клетками. Кроме того, дифференцированные стволовые клетки жировой ткани свиньи могут быть идентифицированы как адипоциты, остеоциты или хондроциты с помощью специфических красителей для тканей, что подтверждает сохранение клетками стромально-васкулярной фракции мультипотентности, типичной для предшественников мезенхимального типа.

При выполнении данной процедуры важно соблюдать правила асептики при работе с культурами клеток и выполнять все этапы максимально быстро, чтобы обеспечить максимальную жизнеспособность клеток. При должном освоении техники сбор клеток от двух-трех свиней может быть осуществлен в течение шести часов.

Этот стандартный метод открыл исследователям ожирения в области диабета возможность изучить молекулярные переключатели, такие как факторы транскрипции, которые контролируют дифференцировку адипоцитов. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как выделять стволовые клетки из жировой ткани свиньи и оценивать мультипотентность этих клеток при дифференцировке в адипоциты, остеоциты и хондроциты.