Иммуномагнитного Разделение жировое депо-специфической СЦА1

Общая цель данной процедуры заключается в выделении Sca1-положительных мезенхимальных стволовых клеток из различных жировых депо мыши. Основным преимуществом этого метода является то, что использование иммуномагнитной сортировки клеток позволяет эффективно обогащать популяцию стволовых клеток, полученных из различных жировых депо, для последующих экспериментов. Как правило, исследователи, впервые применяющие этот метод, могут столкнуться с трудностями, так как интенсивность и продолжительность переваривания тканей коллагеназой должны быть оптимизированы для получения достаточного количества клеток для сортировки.

Для выделения подкожных жировых депо поместите мышь на пенопластовую препарировочную доску в положение на спине и обработайте животное распылением 70% ethanol. После фиксации лап к доске сделайте небольшой разрез кожи в нижней части живота. Затем, захватив верхний край разреза пинцетом, с помощью ножниц отделите кожу и брюшину от брюшной стенки в направлении от живота к грудной клетке.

Сделайте боковые разрезы кожи вдоль туловища и отгибайте кожу от брюшины в направлении головы. Затем оттяните оставшуюся кожу, удерживая паховый жир в стороне от тела, и закрепите кожу на доске с помощью игл 22 gauge. Далее с помощью пинцета захватите одну паховую жировую подушечку у ее основания рядом с брюшиной и с помощью тонких ножниц аккуратно отделите жир от кожи, двигаясь в сторону паха, чтобы избежать попадания фрагментов кожи в подкожную жировую подушечку.

Затем поместите изолированную паховую жировую подушку в чашку диаметром 60 мм с пометкой SQ, содержащую культуральную среду при температуре 37 °C, и аналогичным образом извлеките паховую жировую подушку с другой стороны животного. Для выделения висцеральных жировых подушек разрежьте брюшину, чтобы открыть доступ к висцеральным жировым подушкам и кишечнику. Затем отодвиньте кишечник в сторону грудной клетки.

Захватите жировую подушку висцерального жира за дистальный конец, осторожно потяните за жировую ткань и выделите ее, стараясь не захватить ткань придатка семенника. Затем поместите жировую подушку в чашку диаметром 60 мм с пометкой VIS, содержащую культуральную среду при температуре 37 °C. После сбора всех жировых подушек перенесите чашки в ламинарный шкаф для культивирования тканей и аспирируйте среду.

Используйте изогнутые ножницы, чтобы измельчить жировые подушки. Затем поместите кусочки жира в отдельные пробирки объемом 50 мл, содержащие свежеприготовленный коллагеназный раствор. После этого встряхивайте пробирки при 300 об/мин и 37 °C в течение 10–20 минут до полного переваривания тканей.

Могут оставаться видимыми фрагменты ткани подкожной жировой клетчатки. Добавьте 20 миллилитров культуральной среды в раствор коллагеназы, чтобы остановить процесс переваривания, и с помощью серологической пипетки объемом 10 миллилитров 10 раз аспирируйте и вытесните суспензию тканей для полной диссоциации переваренных тканей. Профильтруйте клетки через клеточные сита с порами 100 микрон и центрифугируйте ткани.

Затем осторожно слейте среду, стараясь не потревожить осадок, и аккуратно ресуспендируйте обе группы клеток в пяти миллилитрах стерильной воды. Подождите две минуты до полного лизиса эритроцитов. После этого остановите реакцию в каждой пробирке, добавив 25 миллилитров среды с добавлением FBS.

Профильтруйте обе популяции адипоцитов через новые клеточные фильтры с размером пор 100 микрон, снова центрифугируйте их, после чего ресуспендируйте осадки в 1–3 миллилитрах среды. После подсчета методом исключения трипанового синего распределите по отдельности 1 × 10⁶ клеток жировой ткани подкожной клетчатки и висцеральных клеток в отдельные лунки шестилуночного планшета для культивирования клеток. После трипсинизации клеток разбавьте трипсин одним миллилитром буфера для разделения, а затем центрифугируйте планшеты с культурами.

Мы суспендируем клетки в 500 µL буфера для сепарации на одну пробирку и снова центрифугируем их. Затем ресуспендируйте клетки в 90 µL буфера для сепарации на одну пробирку и добавьте в суспензию клеток 10 µL первичного антитела anti-Sca1 FITC. После 10 минут инкубации при 4 °C в темноте промойте клетки одним миллилитром буфера для сепарации на одну пробирку.

После центрифугирования клетки ресуспендируют в 80 мкл буфера для сепарации на каждую суспензию клеток. Затем в каждую лунку добавляют 20 мкл микросфер Anti-FITC и выдерживают планшеты при температуре 4 °C в защищенном от света месте в течение 15 минут. По окончании инкубации клетки промывают 1 мл буфера для сепарации и ресуспендируют в 500 мкл свежего буфера на пробирку.

Теперь поместите колонку в магнитный держатель и промойте ее 500 µL буфера для разделения. Перенесите клетки из культуры тканей подкожно-жировой клетчатки в колонку, стараясь избегать образования пузырьков, и соберите немаркированные Sca1-отрицательные клетки в коническую пробирку объемом 15 мл. После того как все клетки пройдут через колонку, промойте ее трижды 500 µL буфера для разделения.

Затем перенесите колонку с магнита в новый конический центрифужный пробирку объемом 15 миллилитров и пропустите один миллилитр свежего буфера для разделения через колонку для элюции Sca1-положительных клеток. В завершение центрифугируйте фракции Sca1-положительных и Sca1-отрицательных клеток, после чего ресуспендируйте осадки в одном миллилитре культуральной среды. Затем подсчитайте количество клеток в каждой фракции и распределите их по отдельным лункам нового шестилуночного планшета для культивирования клеток.

Сосудистые стромальные клетки, выделенные из подкожного жира, имеют вытянутую форму, характерную для фибробластов, независимо от уровня экспрессии Sca1. Подобно клеткам с высокой экспрессией Sca1, полученным из подкожного пахового жира, клетки с высокой экспрессией Sca1, полученные из висцерального придаткового жира, имеют вытянутую фибробластоподобную форму. В то время как VIS-клетки с низкой экспрессией Sca1 имеют эпителиоподобную форму.

Клетки с высоким уровнем экспрессии Sca1, выделенные из мышей Sca1-GFP, легко идентифицируются как GFP-положительные клетки в культурах тканей. Действительно, при анализе этих клеток методом проточной цитометрии подтверждается, что большинство GFP-положительных клеток экспрессируют белки Sca1 на поверхности клеток, что определяется с помощью антител к Sca1. В сочетании с анализом методом ПЦР в реальном времени можно продемонстрировать различие в экспрессии коллагенолитических матриксных металлопротеиназ между Sca1-высокими жировыми мезенхимальными стволовыми клетками, полученными из пахового и придаточного жира.

Кроме того, при использовании гелей из коллагена I типа, меченных флуоресцеином, для оценки перицеллюлярной деградационной активности наблюдается заметное повышение активности ремоделирования коллагена, опосредованного висцеральными Sca1 high стволовыми клетками, производными жировой ткани. После освоения метода выделение клеток из жировой подушки может быть завершено за два часа при условии правильного выполнения процедуры. При проведении данной манипуляции важно помнить о необходимости поддержания чистоты и порядка в операционном поле для обеспечения эффективного выделения жировой подушки.

После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, такие как анализ деградации коллагена, чтобы получить ответы на дополнительные вопросы о ремоделировании тканей, опосредованном стволовыми клетками жировой ткани. После разработки этот метод открыл исследователям в области ожирения и биологии матрикса путь к изучению роли стволовых клеток жировой ткани в ремоделировании и функционировании жировой ткани у мышей и людей. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как выделять и обогащать первичные Sca1-положительные клетки из депо жировой ткани.