Иммуномагнитного Разделение жировое депо-специфической СЦА1

Общая цель этой процедуры заключается в выделении Sca1-положительных мезенхимальных стволовых клеток из различных жировых отложений мышей. Основное преимущество этой методики заключается в том, что с помощью иммуномагнитной сортировки клеток на основе гранул стволовые клетки, полученные из жировых отложений, могут быть эффективно обогащены для последующих экспериментов. Как правило, исследователи, не знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что сила и продолжительность опосредованного коллагеназой переваривания тканей должны быть оптимизированы для получения достаточного количества клеток для сортировки.

Чтобы изолировать подкожные жировые пакеты, начните с того, что поместите мышь на пенопластовую доску для препарирования в лежачем положении и распылите на животное 70% этанола. Закрепив лапы к доске, сделайте небольшой надрез на коже нижней части живота. Затем, обхватив щипцами верхнюю часть разреза, с помощью ножниц отделите кожу и брюшину от живота до грудной клетки.

Делая боковые надрезы на коже, по бокам тела, отражайте кожу от брюшины в сторону головы. Затем оттяните оставшуюся кожу, удерживая паховый жир подальше от тела, и с помощью игл 22 калибра прикрепите кожу к доске. Затем с помощью щипцов захватите одну паховую жировую подушку в ее начале возле брюшины, и с помощью тонких ножниц проведите между кожей и паховым жиром, продвигаясь к паху, и избегайте загрязнения подкожного жирового пакета кожей.

Затем поместите изолированный паховый жировой пакет в 60-миллиметровую миску с маркировкой SQ, содержащую питательную среду с температурой 37 градусов Цельсия, и таким же образом соберите паховый жировой пакет с другой стороны животного. Чтобы изолировать висцеральные жировые пакеты, разрежьте брюшину, чтобы обнажить висцеральные жировые пакеты и кишечник. Затем отодвиньте кишку в сторону, по направлению к грудной клетке.

Взявшись за висцеральный жировой пакет на дистальном конце, аккуратно потяните вверх жировую ткань и рассеките ее, стараясь исключить ткань придатка яичка. Затем поместите жировую подушку в 60-миллиметровую посуду с маркировкой VIS, содержащую питательную среду с температурой 37 градусов Цельсия. Когда все жировые пакеты будут собраны, перенесите чашки в капюшон для культуры тканей и аспирируйте среду.

Используйте изогнутые ножницы, чтобы измельчить подушечки. Затем добавьте кусочки жира в отдельные 50-миллилитровые пробирки, содержащие свежеприготовленную коллагеназу. Затем встряхните пробирки при 300 об/мин и 37 градусах Цельсия в течение 10-20 минут, пока ткани не переварятся.

Некоторые кусочки подкожной жировой ткани все еще могут быть видны. Добавьте 20 миллилитров питательной среды в раствор коллагеназы, чтобы остановить пищеварение, и используйте серологическую пипетку объемом 10 миллилитров для аспирации и дозирования тканевой суспензии 10 раз, чтобы полностью диссоциировать переваренные ткани. Отфильтруйте клетки через клеточные сетчатые фильтры 100 микрон и центрифугируйте ткани.

Затем тщательно сцедите среду, стараясь не потревожить гранулы, и аккуратно ресуспендируйте обе группы клеток в пяти миллилитрах стерильной воды. Подождите две минуты, пока эритроциты будут лизированы. Затем остановите реакцию в каждой пробирке с 25 миллилитрами среды, дополненной FBS.

Отфильтруйте обе популяции адипоцитов через новые 100-микронные клеточные фильтры, снова понизьте их, а затем повторно суспендируйте гранулы в одном-трех миллилитрах среды. После подсчета методом исключения трипанового синего планшета отдельно поставьте один раз на десять-шестую подкожные жировые отложения клеток и висцеральных клеток в отдельные лунки шестилуночного клеточного культурального планшета. После трипсинизации клеток разведите трипсин с одним миллилитром разделительного буфера, а затем центрифугируйте культуральные планшеты.

Суспензируем клетки по 500 микролитров на пробирку разделительного буфера, и снова центрифугируем клетки. Теперь повторно суспендируйте клетки в 90 микролитрах на пробирку разделительного буфера и смешайте 10 микролитров первичного антитела против Sca1 FITC в клеточную суспензию. После 10 минут инкубации при четырех градусах Цельсия в темноте промойте клетки одним миллилитром разделительного буфера на каждую пробирку.

После вращения клетки ресуспендируются в 80 микролитрах разделительного буфера на клеточную суспензию. Затем смешайте 20 микролитров микрогранул Anti-FITC в каждую лунку и поместите пластины при температуре четыре градуса Цельсия в защищенном от света месте на 15 минут. В конце инкубации промойте клетки в одном миллилитре разделительного буфера, и повторно суспендируйте клетки в 500 микролитрах свежего буфера на пробирку.

Теперь поместите колонку в магнитный держатель и промойте колонку 500 микролитрами сепаратонного буфера. Перенесите клетки из культуры ткани подкожного жирового слоя на колонку, стараясь не допустить образования пузырьков, и соберите немеченные Sca1-отрицательные клетки в коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Когда все ячейки будут проработаны, трижды промойте колонку 500 микролитрами разделительного буфера.

Затем перенесите колонку с магнита в новую коническую трубку объемом 15 миллилитров и пропустите через колонку один миллилитр свежего разделительного буфера, чтобы элюировать Sca1-положительные клетки. Наконец, уменьшите как положительные, так и отрицательные клеточные фракции Sca1 и повторно суспендируйте гранулы в одном миллилитре питательной среды. Затем подсчитайте количество клеток в каждой фракции и поместите фракции в отдельные лунки нового шестилуночного планшета для культивирования клеток.

Сосудистые стромальные клетки, выделенные из подкожно-жировой клетчатки, демонстрируют фибробластоподобную, растянутую клеточную форму независимо от уровня экспрессии Sca1. Подобно подкожным высоким клеткам Sca1, полученным из пахового жира, высокие клетки Sca1 висцерального придатка яичка яичка демонстрируют растянутую форму, похожую на фибробласты. В то время как низкие клетки VIS Sca1 демонстрируют эпителиоидную форму.

Клетки с высоким уровнем Sca1, выделенные из изолированных мышей Sca1-GFP, легко идентифицируются как GFP-положительные клетки в культуре тканей. Действительно, когда эти клетки оцениваются с помощью проточной цитометрии, подтверждается, что большинство GFP-положительных клеток экспрессируют белки Sca1 на своих клеточных поверхностях, что обнаруживается антителами против Sca1. В сочетании с ПЦР-анализом в реальном времени можно продемонстрировать дифференциальную экспрессию коллагенолитических матриксных металлопротеиназ между паховыми стволовыми клетками Sca1 с высоким содержанием жировой ткани, полученными из пахового и эпидидимального жира.

Кроме того, при использовании меченых флуоресцеином коллагеновых гелей I типа для оценки активности периклеточной деградации наблюдается заметно повышенная активность ремоделирования коллагена, опосредованная висцеральными стволовыми клетками Sca1 высокого жирового происхождения. После освоения изоляция клеток жирового пакета может быть завершена за два часа, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о поддержании чистоты и организованности операционного поля, чтобы обеспечить эффективную изоляцию жировых пакетов.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как анализ деградации коллагена, чтобы ответить на дополнительные вопросы о ремоделировании тканей, опосредованном стволовыми клетками жировой ткани. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области ожирения и матричной биологии для изучения роли стволовых клеток, полученных из жировой ткани, в ремоделировании и функционировании жировой ткани у мышей и людей. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как добывать и обогащать первичные Sca1-положительные клетки из депо жировой ткани.