Одновременное обнаружение с-Fos активации от мезолимбическом и мезокортикальных Награда сайты Допамин После Наивное сахара и жира При приеме внутрь в Rats

Общая цель этого экспериментального протокола состоит в том, чтобы определить, будут ли VTA и его основные мезотеленсфатические проекционные зоны DA демонстрировать координатную и одновременную активацию c-Fos после нового приема растворов кукурузного масла, глюкозы, фруктозы или сахарина. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, такие как мотивация, и определить, активируются ли несколько участков мозга скоординированным образом в ответ на приятные стимулы. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она сочетает в себе установленные поведенческие анализы, методы клеточной активации и статистический анализ.

Для настройки аппарата используйте калиброванную центрифужную трубку со стопором грабителя и металлическую трубку под углом 45 градусов, чтобы обеспечить точное измерение раствора, представленного крысе. Закрепите его на домашней клетке с помощью тугой металлической пружины, чтобы обеспечить видимость калибровки. За три-пять дней до тренировки ограничьте рацион питания крысы, чтобы снизить массу ее тела до 85% от исходного веса, чтобы повысить мотивацию к потреблению раствора.

В то же время, давайте животному 10 миллилитров предтренировочного раствора с 0,2% сахарина в течение четырех дней в течение одного часа, чтобы максимизировать вероятность того, что крыса будет пробовать последующий тестовый раствор с короткой задержкой. Взвешивайте пробирку до и после каждого сеанса, чтобы получить измерение впуска. Затем на пятый день проведите вступительный тест в подгруппах, получающих одно из шести решений.

Убедитесь, что на крысах отобран раствор с короткой задержкой, и исключите испытуемых из исследования, если это требование не выполнено. Чтобы подготовить ткань, после принесения животного в жертву, быстро удалите мозг из черепа. С помощью ронжеров аккуратно разломайте и удалите кость из мозга, начиная с задней части вперед.

Работайте в области ниже мозжечка и убедитесь, что ронжеры находятся между костью и менингеальной мозговой оболочкой. После того, как верхняя и боковые стороны черепа будут удалены, используйте небольшой шпатель, чтобы поднять мозг от его основания, и отрежьте черепно-мозговые нервы маленькими ножницами. Затем зафиксируйте мозг в 4% растворе параформальдегида на ночь при температуре четыре градуса Цельсия.

На следующий день поместите мозг в раствор сахарозы комнатной температуры, пока он не осядет на дне емкости. После этого извлеките обонятельную луковицу. Впоследствии удалите мозжечок и мост.

Затем смонтируйте головной мозг коронально, при этом каудальная часть будет закреплена на сцене микротома, и разрежьте корональные срезы по 40 микрометров. Во время этой процедуры обрабатывайте срезы пятью миллилитрами 5% обычной козьей сыворотки и 0,2% Тритона x-100 в PBS в течение одного часа. Далее инкубируют обработанные срезы с первичным антителом при температуре четыре градуса Цельсия в течение 36 часов, в лунках, содержащих один миллилитр PBS.

Через 36 часов прополощите срезы три раза пятью миллилитрами PBS в течение 10 минут каждый раз. Затем инкубируйте срезы со вторичным антителом при комнатной температуре в течение двух часов, в лунках, содержащих один миллилитр PBS. После этого промойте срезы три раза в пяти миллилитрах PBS в течение 10 минут каждый раз.

Затем инкубируйте промытые срезы в течение двух часов в имеющейся в продаже смеси пероксидазы хрена Avidin. Через два часа промойте срезы три раза в пяти миллилитрах PBS, каждый раз по десять минут. Затем проведите реакцию с DAB в присутствии перекиси водорода в течение пяти-десяти минут.

После этого дважды пометьте срезы VTA, инкубируя их с антителом к тирозингидроксилазе в пяти миллиметрах PBS в течение ночи при четырех градусах Цельсия. На следующий день промойте срезы три раза в пяти миллилитрах PBS, каждый раз по десять минут. После этого инкубируйте срезы со вторичным антителом в пяти миллилитрах PBS, при комнатной температуре, в течение двух часов.

Через два часа промойте срезы три раза в пяти миллилитрах PBS, каждый раз по десять минут. Чтобы визуализировать антитело с помощью вторичного комплекса пероксидазы антител, прореагируйте его с комбинацией DAB и 0,3%-ным раствором сульфата никеля в течение пяти-десяти минут. Подсчитайте ячейки, дважды щелкнув значок программы.

Перейдите в строку меню, нажмите «Получение», а затем «Живое изображение». После этого сфокусируйтесь на интересующей вас области и щелкните по экрану, чтобы установить точку отсчета. Затем перейдите на панель инструментов сетки и нажмите Отобразить сетку и Использовать подписи сетки.

Очертите область интереса с помощью заранее определенной трассировки. Затем подсчитайте все ячейки в каждой интересующей области и выберите «Плюс» на левой боковой панели, чтобы зарегистрировать количество ячеек c-Fos. Рассмотрим клетку, положительную на c-Fos, когда наблюдается определенный темно-красный круг.

Повторите этот процесс для каждого сайта и убедитесь, что надежность двух неосведомленных оценщиков для каждого раздела в каждом интересующем регионе всегда превышает 0,8. После этого подсчитайте c-Fos положительные нейроны в интересующих областях. Определите, присутствует ли иммунореактивность c-Fos в TH-положительных и TH-отрицательных клетках в VTA.

Это изображение показывает, что потребление жиров или сахара дифференциально увеличивает активацию c-Fos во всей миндалевидном теле, а также в базолатеральной и центрально-кортико-медиальной подобластях миндалевидного тела. На этом изображении фактическая активация c-Fos миндалевидного тела наблюдалась у животных, подвергшихся воздействию потребления кукурузного масла, глюкозы, а также фруктозы. Активация C-Fos в ОТА также наблюдалась у животных, подвергшихся воздействию кукурузного масла и воды.

Черными стрелками обозначены репрезентативные, дважды меченые, TH-c-Fos положительные клетки, в то время как серыми стрелками обозначены только репрезентативные c-Fos клетки. После освоения этой техники ее можно сделать за три-четыре недели, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о точном следовании методологии, хранении и подсчете.

Спасибо за просмотр, и удачи в ваших экспериментах.