In Vitro разборке вируса гриппа капсиды по градиентное центрифугирование

Общая цель этого центрифугирования с градиентом скорости заключается в анализе капсидов вируса гриппа А в условиях, имитирующих эндоцитарную среду, с которой входящие вирусы сталкиваются при проникновении в клетки. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о том, как капсиды вируса гриппа А распадаются во время проникновения в клетку, например, о специфическом влиянии умеренно кислого pH на стабильность капсида. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет проводить количественный анализ процесса раскрытия вируса гриппа А в определенных экспериментальных условиях.

Помимо того, что этот метод дает представление о том, как инициируется раскрытие оболочки вируса гриппа А, он также может быть применен для изучения других оболочечных вирусов с соответствующими механизмами раскрытия покрытия. Демонстрировать эту процедуру будет Фират Неблоглу, бывший студент моей лаборатории. После приготовления исходных буферов и реагентов в соответствии с текстовым протоколом, для каждого тестируемого условия рН, приготовьте мастер-смесь буфера для моющих средств, смешав девять миллилитров одного молярного хлорида натрия, шесть миллилитров 10% NP40, 2,4 миллилитра запаса ингибитора протеазы 25X и девять миллилитров дважды дистиллированной воды.

Затем для каждого условия pH пипетируйте 4,4 миллилитра мастер-смеси в 50-миллилитровую коническую пробирку. При значениях pH выше 5,8 добавьте в пробирку 0,6 миллилитра соответствующего стокового раствора 500 milliMolar Tris с поправкой на pH. Для значений pH 5,8 и ниже добавьте 0,6 мл соответствующего стокового раствора 500 мМоляр MES с поправкой на pH.

Приготовьте пять миллилитров буферного раствора, содержащего 300 миллиМоляр натрия хлорида, 2X ингибитор протеазы, 60 миллиМоляр Трис, доведенный до pH 7,4, и дважды дистиллированную воду. Он будет служить буфером для контроля градиента без моющих средств. Затем добавьте пять миллилитров 50% глицерина к пяти миллилитрам буферных смесей, содержащих и не содержащих моющие средства, в результате чего получится шесть различных растворов 25% глицерина.

Используйте полоски pH для проверки значений pH. Приготовьте 15%-ный раствор глицерина, смешав 50%-ный глицериновый бульон в соотношении три-семь с дистиллированной водой. С помощью пятимиллилитрового шприца и иглы добавьте три миллилитра 15%-ного раствора глицерина в шесть ультрапрозрачных центрифугирующих пробирок.

Промывайте иглу в воде двойной дистилляции после каждого шага. С помощью пятимиллилитрового шприца и длинной иглы осторожно введите 3,4 миллилитра 25%-ного раствора глицерина под 15%-ный слой глицерина, стараясь не перепутать два слоя. Граница между обоими слоями хорошо видна.

Повторите это для всех шести условий для тестирования с соответствующими растворами глицерина с поправкой на pH. Затем в шкафу биобезопасности класса II используйте один миллилитр осветленной, разбавленной аллантоевой жидкости, содержащей вирус гриппа А, чтобы аккуратно наложить градиенты глицерина. Переложите пробирки в ведра ротора, уравновесьте противоположные пробирки и осторожно поместите их в предварительно охлажденный ультрацентрифугирующий ротор SW-41.

Центрифугируйте при 2100 об/мин и 12 градусах Цельсия в течение 150 минут. После центрифугирования с помощью чистой пастеровской пипетки и аспиратора осторожно удалите оба слоя глицерина. Затем с помощью 40 миллилитров 1X невосстановительного буфера для образцов LDS полностью ресуспендируйте гранулу путем пипетирования вверх и вниз перед переносом образца в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров.

Для проведения SDS-PAGE нагрейте все образцы при температуре 95 градусов Цельсия в течение 10 минут. Загрузите 20 микролитров растворенных гранул в сборный градиентный мини-гель Bis-Tris и работайте при напряжении 200 Вольт в течение одного часа в рабочем буфере 1X MOPS SDS. Выдержать гель в фиксирующем растворе в течение одного часа.

Смойте один-два раза водой, и окрашивайте на ночь в 15-сантиметровой чашке для клеточных культур достаточным объемом коллоидного раствора кумасси, слегка встряхивая при комнатной температуре. Обесцвечивайте гель в дважды дистиллированной воде, заменяя жидкость каждые 15-20 минут, пока гелевый фон не станет прозрачным. Храните гель в дважды дистиллированной воде при температуре четыре градуса Цельсия до тех пор, пока он не будет отсканирован для количественного определения полосы.

Наконец, отсканируйте гель с высоким разрешением и используйте коммерчески доступное специализированное программное обеспечение для количественной оценки интенсивности белковой полосы. Вычтите фоновый сигнал из области, близкой к соответствующим полосам, и нормализуйте значения до контрольных значений без моющих средств. В этом эксперименте X31, полученный из осветленной аллантоисной жидкости, был подвергнут центрифугированию с градиентом скорости при уровнях pH от 7,4 до 5,0 и проанализирован с помощью SDS-PAGE.

Без детергента, присутствующего в градиенте, неповрежденные вирионы гранулируются, что отражено в характерном рисунке полос, представляющих HA, NP и M1 в геле, окрашенном Кумасси. При добавлении NP40 к нижнему слою глицерина вирусная оболочка, включая HA, NA и M2, была солюбилизирована, и только вирусное ядро оседало в грануле во время ультрацентрифугирования. Начиная с pH ниже 6,5, M1 постепенно теряется из гранулированной фракции, достигая минимума между pH 5,8 и pH 5,4.

При рН ниже 5,8 vRNP диссоциировались и, таким образом, терялись из гранулы. Из проанализированных белковых полос были выявлены два различных порога рН для разборки слоя М1 и диссоциации пучков vRНП, включая рН 6,5 и рН 5,8 соответственно. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что в зависимости от конкретного штамма вируса гриппа А или мутанта могут наблюдаться различные свойства разборки.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как электронная микроскопия, чтобы получить дополнительную информацию, такую как структура изолированных капсидов вируса гриппа.