In Vitro разборке вируса гриппа капсиды по градиентное центрифугирование

Общей целью данного центрифугирования в градиенте плотности с определением скорости осаждения является анализ капсидов вируса гриппа А в условиях, имитирующих эндоцитозную среду, с которой сталкиваются вирусы при проникновении в клетку. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы о том, как происходит разборка капсидов вируса гриппа А при проникновении в клетку, например, о специфическом влиянии слабокислого pH на стабильность капсида. Основным преимуществом данной методики является возможность количественного анализа процесса раздевания вируса гриппа А в определенных экспериментальных условиях.

Помимо предоставления сведений о том, как инициируется разраздевание вируса гриппа A, этот метод может быть применен и для изучения других оболочечных вирусов с аналогичными механизмами разраздевания. Процедуру продемонстрирует Фират Неблоглу, бывший студент моей лаборатории. После приготовления основных буферов и реагентов в соответствии с текстовым протоколом, для каждого тестируемого значения pH приготовьте мастер-микс детергентного буфера, смешав 9 мл 1 M раствора хлорида натрия, 6 мл 10% NP40, 2,4 мл 25X стокового раствора ингибитора протеаз и 9 мл дважды дистиллированной воды.

Затем для каждого значения pH перенесите пипеткой 4,4 milliliters мастер-микса в коническую пробирку объемом 50 milliliter. Для значений pH выше 5,8 добавьте в пробирку 0,6 milliliters соответствующего стокового раствора 500 milliMolar Tris с отрегулированным значением pH. Для значений pH 5,8 и ниже добавьте 0,6 milliliters соответствующего стокового раствора 500 milliMolar MES с отрегулированным значением pH.

Приготовьте пять миллилитров буферного раствора, содержащего 300 mM NaCl, 2X ингибитор протеаз, 60 mM Tris при pH 7,4, и дважды дистиллированную воду. Данный раствор будет использоваться в качестве контрольного градиентного буфера без детергента. Затем добавьте пять миллилитров 50% стокового раствора глицерина к пяти миллилитрам смесей буферов с детергентом и без него, чтобы получить шесть различных 25% растворов глицерина.

Для проверки значений pH используйте pH-полоски. Приготовьте 15% раствор глицерина, смешав стоковый 50% раствор глицерина с дистиллированной водой в соотношении от трех к семи. С помощью шприца объемом 5 mL и иглы добавьте по 3 mL 15% раствора глицерина в шесть ультрапрозрачных центрифужных пробирок.

Промывайте иглу в бидистиллированной воде после каждого этапа. С помощью шприца объемом 5 мл и длинной иглы осторожно введите 3,4 мл 25% раствора глицерина под слой 15% глицерина, стараясь не смешивать эти два слоя. Интерфейс между обоими слоями будет четко виден.

Повторите эту процедуру для всех шести условий тестирования с соответствующими растворами глицерина с отрегулированным pH. Затем в боксе биологической безопасности II класса осторожно нанесите один миллилитр осветленной разбавленной аллантоической жидкости, содержащей вирус гриппа А, поверх глицериновых градиентов. Перенесите пробирки в стаканы ротора, сбалансируйте противоположные пробирки и аккуратно поместите их в предварительно охлажденный ротор для ультрацентрифугирования SW-41.

Центрифугируйте при 2100 об/мин и 12 °C в течение 150 минут. После центрифугирования с помощью чистой пастеровской пипетки и аспиратора осторожно удалите оба слоя глицерина. Затем, добавив 40 мл 1X невосстанавливающего буфера для образцов LDS, полностью ресуспендируйте осадок путем пипетирования до однородности, после чего перенесите образец в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.

Для проведения SDS-PAGE все образцы нагревают при 95 °C в течение 10 минут. 20 µL растворенных осадков наносят на готовый градиентный Bis-Tris мини-гель и разделяют при 200 V в течение одного часа в 1X MOPS SDS-буфере для электрофореза. Гель инкубируют в фиксирующем растворе в течение одного часа.

Промойте один или два раза водой, затем оставьте на ночь для окрашивания в чашке для культивирования клеток диаметром 15 сантиметров с достаточным объемом раствора коллоидного Кумасси при осторожном встряхивании при комнатной температуре. Проведите обесцвечивание геля в двукратно дистиллированной воде, заменяя жидкость каждые 15–20 минут до тех пор, пока фон геля не станет прозрачным. Храните гель в двукратно дистиллированной воде при температуре четырех градусов Цельсия до проведения сканирования для количественного определения полос.

Наконец, просканируйте гель с высоким разрешением и используйте доступное в продаже специализированное программное обеспечение для количественного определения интенсивности белковых полос. Вычтите фоновый сигнал из области, расположенной рядом с соответствующими полосами, и нормируйте полученные значения по значениям контрольного образца без детергента. В данном эксперименте X31, выделенный из очищенной аллантоической жидкости, подвергали центрифугированию в градиенте плотности при значениях pH от 7.4 до 5.0 с последующим анализом методом SDS-PAGE.

В отсутствие детергента в градиенте целые вирионы осаждаются, что отражается в характерном паттерне полос, представляющих HA, NP и M1 на геле, окрашенном кумасси. После добавления NP40 в нижний глицериновый слой вирусная оболочка, включая HA, NA и M2, сольватировалась, и в результате ультрацентрифугирования в осадок выпал только вирусный кор. При значениях pH ниже 6,5 из фракции осадка постепенно исчезает M1, достигая минимума в диапазоне от pH 5,8 до pH 5,4.

При значении pH ниже 5.8 vRNP диссоциировали и, следовательно, вымывались из осадка. Анализ белковых полос выявил два различных порога pH для разборки слоя M1 и диссоциации пучков vRNP, которые составили pH 6.5 и pH 5.8 соответственно. При выполнении данной процедуры важно помнить, что в зависимости от конкретного штамма или мутанта вируса гриппа А могут наблюдаться различные свойства разборки.

После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, например электронную микроскопию, для получения дополнительных данных, таких как структура изолированных капсидов вируса гриппа.