Применения с одним зондом: Масс-спектрометрия и цифровой обработки изображений Single Cell Анализ в условиях окружающей среды

Общая цель этого метода заключается в создании микромасштабного устройства для отбора проб, Single-probe, для анализа живых одиночных клеток с помощью масс-спектрометрии в условиях окружающей среды. А также для выполнения масс-спектрометрической визуализации биологических тканей с высоким пространственным разрешением. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы биологических и фармацевтических исследований.

Например, какие молекулы присутствуют в живых одиночных клетках и как они распределяются в тканях. Основное преимущество этого метода заключается в том, что однозондовый датчик является многофункциональным устройством, которое может быть использовано как для анализа живых одиночных клеток, так и для экспериментов по масс-спектрометрии с высоким разрешением. Хотя этот метод позволяет анализировать отдельные клетки и ткани, он также может быть применен к другим системам, где желателен микромасштабный отбор проб, таким как анализ химических веществ и живых микроколоний и биопленок.

Вместе со мной эту процедуру будет демонстрировать Вэй Рао, постдок из моей лаборатории. Поместите целый интересующий вас орган мыши в центр небольшого пластикового углубления. Погрузите орган в ткань для заделки на высоту около 10 мм.

Сразу же поместите ткани в жидкий азот для мгновенной заморозки. Чтобы подготовить срез мышиной ткани, возьмите замороженный орган мыши и разморозьте до 15 градусов Цельсия в криомикротоме с регулируемой температурой. Закрепите ткань на стальном основании с помощью примерно 500 микролитров заделочного состава и поместите на крепление для секционирования криомикротома так, чтобы нож получил желаемую ориентацию для секционирования.

Разрежьте ткань до толщины 12 микрон. Затем поместите разрезанные срезы ткани на предметные стекла поликарбонатного микроскопа и дайте им высохнуть в течение 30 минут при комнатной температуре. Возьмите образец клетки, например, 1 миллилитр суспензии клеток HeLa, и добавьте его в 9 мл полной среды для клеточной культуры в стандартной 10-сантиметровой клеточной культуральной тарелке.

Держите клетки в культуре при температуре 37 градусов Цельсия с 5% CO2 в течение двух-трех дней, пока поверхность выращивания не будет покрыта на 70-80% на планшете для клеточной культуры. Выполните пассирование клеток в планшете для культивирования клеток. Для этого аспирируйте питательную среду и промойте клетки 5 мл 1x фосфатно-солевого буфера.

Удалите PBS с помощью стерильного аспирационного наконечника и инкубируйте клетки с 2,5 мл трипсина в течение примерно 5 минут при 37 градусах Цельсия, чтобы отделить клетки от культурального планшета. Остановите активность трипсина, добавив 7,5 мл полной среды для культивирования клеток, а затем равномерно ресуспендируйте клетки. Чтобы подготовить образцы клеток к одноклеточной масс-спектрометрии, или эксперименту SCMS, сначала поместите отдельные предметные стекла микропокрытия в лунки 12-луночного планшета.

Затем добавьте в лунку 1,8 мл среды для клеточных культур и 0,2 мл клеточной суспензии. Осторожно перемешайте клетки с легким перемешиванием планшета перед инкубацией в среде с 5% CO2 при температуре 37 градусов Цельсия в течение примерно 24 часов. Для проведения медикаментозной обработки культивируемых клеток в 12-луночный планшет для культивирования клеток добавляют раствор лекарственного соединения.

Поместите кварцевую трубку с двойным отверстием в лазерный съемник для микропипеток и потяните за кварцевую иглу с двумя отверстиями. В качестве отправной точки установите теплоту на 400, нить накала на три, скорость на 80, задержку на 150 и тягу на 250. Обрежьте вытягивающий наконечник так, чтобы на другом конце осталось примерно 5 мм невытянутого двухкапиллярного кварцевого капилляра.

Отрежьте участок капилляра из плавленого диоксида кремния диаметром 80 мм в качестве капилляра, обеспечивающего растворитель. Затем вставьте капилляр в одно отверстие на плоском конце двухканальной кварцевой иглы. Используя пламя, вытащите капилляр из плавленого кремнезема в качестве излучателя nanoESI, разрежьте его до 7-10 мм в длину и вставьте его в другое отверстие на плоском конце двухпроходной кварцевой иглы.

Нанесите минимальное количество смолы УФ-отверждения на плоский конец кварцевой иглы с двойным отверстием. Затвердейте смолу с помощью светодиодной ультрафиолетовой лампы в течение примерно 20 секунд, чтобы закрепить капилляр, обеспечивающий растворитель, и излучатель nanoESI. Далее разрежьте на стандартном микроскопе предметное стекло пополам вдоль.

Затем поместите одиночный зонд на один конец предметного стекла так, чтобы излучатель nanoESI был направлен наружу. Нанесите обычную эпоксидную смолу на корпус одинарного щупа так, чтобы она закрепилась на предметном стекле, прежде чем оставить на ночь для затвердевания. Эта система включает в себя специализированный фланец интерфейса ионного источника масс-спектрометра и алюминиевую оптическую плату, которая прикреплена к цифровому USB-микроскопу, миниатюрному ручному столику для трансляции XYZ и моторизованной системе трансляционного стола XYZ.

Измените фланец интерфейса ионного источника масс-спектрометра и изготовьте подставку цифрового стереомикроскопа, как описано в текстовом протоколе. Прикрепите к алюминиевой оптической плате модифицированный цифровой стереомикроскоп, цифровой USB-микроскоп, миниатюрный ручной столик для трансляции XYZ с гибким зажимным держателем и моторизованную систему трансляционного столика XYZ. Используйте гибкий зажимной держатель для фиксации стеклянного предметного стекла, прикрепленного с помощью одного щупа.

Затем подключите установку с одним зондом к масс-спектрометру. Отрегулируйте гибкий держатель зажима и миниатюрный столик XYZ, чтобы разместить излучатель одиночного зонда перед входом масс-спектрометра. Разморозьте срез образца при комнатной температуре и поместите его на моторизованную систему трансляционного столика XYZ, расположенную под одним зондом.

Отрегулируйте положение образца, изменив координаты в управляющем программном обеспечении. С помощью шприца прокачайте растворитель для отбора проб с соответствующей скоростью. А затем подайте напряжение ионизации.

Отрегулируйте высоту одиночного зонда так, чтобы он располагался прямо над поверхностью образца и мог выполнять поверхностную экстракцию метаболитов. Осторожно поднимите Z-столик, а затем с помощью цифрового USB-микроскопа отслеживайте изменение расстояния между наконечником одного зонда и поверхностью ткани. Задайте параметры растрирования по интересующему участку в образце.

Для представленных здесь участков почек мыши используйте скорость растрирования 10 микрометров в секунду и расстояние между линиями 20 микрометров. Задайте параметры растрирования по интересующему участку в образце. Для представленных здесь участков почек мыши используйте скорость растрирования 10,0 микрометров в секунду и расстояние между линиями 20 микрометров.

Настройка метода автоматизированного сбора спектров МС с масс-спектрометра. Для MSI с высоким массовым разрешением на образце почки мыши используйте массовое разрешение 60 000, положительный режим 5 кВ, 1 микросканирование, максимальное время инъекции 150 миллисекунд и включенную автоматическую регулировку усиления. Инициируйте сбор данных MSI, а затем создайте образы MS из необработанных файлов MS, как описано в текстовом протоколе.

Настройте систему с одним зондом в соответствии с инструкциями MSI и отрегулируйте расход растворителя. Промойте культивируемые клетки, прикрепленные на предметных стеклах микрокрышки, с помощью PBS для удаления питательных сред и внеклеточных компонентов препарата. Затем поместите содержащее клетку предметное стекло на моторизованную систему трансляционного стола XYZ для проведения эксперимента.

Наведите цифровой стереомикроскоп над образцом на кончик одного зонда, чтобы контролировать проникновение в клетки во время анализа. Используйте цифровой USB-микроскоп на боковой стороне одного зонда для контроля условий работы излучателя nanoESI на одном зонде. Используйте моторизованную программу управления столиком XYZ и цифровой стереомикроскоп, чтобы определить интересующую клетку и точно расположить наконечник одного зонда над образцом.

Начните сбор данных MS до того, как наконечник с одним зондом будет вставлен в ячейку. Опустите пластину, содержащую ячейку, чтобы вытащить наконечник одного зонда из ячейки. Наконец, дайте растворителю течь в течение примерно трех минут, чтобы полностью промыть одинарный зонд.

Была проведена масс-спектрометрическая визуализация участков почек мыши, в результате которой было обнаружено большое количество молекул, присутствующих на поверхности ткани. Построено пространственное распределение и относительное обилие множественных молекул на поверхности ткани. Пространственное разрешение в 8,5 мкм было достигнуто за счет наблюдения резких переходов особенностей, присутствующих в данных масс-спектрометрии.

Изготовление одноклеточного зонда с острым наконечником и открытыми каналами имеет решающее значение для анализа одиночных клеток. Микроскопы необходимы для определения местоположения клеток-мишеней и контроля процесса проникновения в клетки. Изменение сигнала от масс-спектров также дает дополнительную информацию для подтверждения проникновения в клетки.

Большое количество молекул было обнаружено из живых одиночных клеток. При использовании для исследований противораковых препаратов, эксперименты с контрольными клетками используются для демонстрации разницы в лечении противораковыми препаратами. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как изготавливается однозондовый зонд и как это устройство используется для масс-спектрометрического анализа одиночных клеток и масс-спектрометрической визуализации биологических тканей окружающей среды.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, могут испытывать трудности, потому что необходимы подробные инструкции для изготовления однозондового устройства, настройки всей системы и работы с приборами. После освоения анализ отдельных клеток может быть непрерывно выполнен для многих клеток. И каждый анализ занимает менее трех минут.

Завершение эксперимента по визуализации рассеянного склероза может занять несколько часов, в зависимости от размера образца, пространственного разрешения и используемого масс-спектрометра. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что ключевым этапом является изготовление высококачественного одиночного датчика. Кроме того, настройка и работа инструмента имеют решающее значение для успешного проведения эксперимента.

Другие методы могут быть разработаны в соответствии с процедурами, аналогичными представленным здесь. Например, реагенты могут быть добавлены в образец растворителя и могут быть выполнены реакционноспособный анализ одиночных клеток, а также анализ окружающей среды MSI для улучшения обнаружения молекул в образцах. После своего развития этот метод проложил путь исследователям как в анализе одиночных клеток, так и в масс-спектрометрических исследованиях в условиях окружающей среды.

Этот метод потенциально может быть использован для исследований в области клеточной биологии, фармакологических исследований и клинических испытаний. Не забывайте, что работа с острыми кварцевыми капиллярами и УФ-отверждаемой эпоксидной смолой может быть опасной, поэтому при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток и защитных очков от ультрафиолетного излучения.