Измерение флуктуаций кальция в пределах саркоплазматического ретикулума культивируемых клеток гладкой мышцы с использованием FRET на основе конфокальной микроскопии

Общая цель данного метода визуализации заключается в мониторинге колебаний уровней кальция в просвете саркоплазматического ретикулума (SR) в ответ на действие агентов, мобилизующих кальций, конкретно в гладкомышечных клетках сосудов. Этот метод может быть полезен для более прямого изучения клеточного цикла кальция. Например, крайне важно знать взаимосвязь между транспортом кальция в саркоплазматическом ретикулуме и стрессом эндоплазматического ретикулума (ER).

Преимущество данного метода заключается в том, что мы можем напрямую измерять уровень кальция внутри просвета саркоплазматического ретикулума, а не экстраполировать его на основании косвенных измерений изменений в цитоплазме. Эту методику продемонстрирует Габриэла Зиомек, аспирантка моей лаборатории. Для начала процедуры приготовьте разведение белковой смеси в DMEM в пропорции от 1 к 25.

Затем перенесите по 200 µL смеси белков в DMEM в каждую стеклянную планшетку диаметром 35 мм, чтобы полностью покрыть внутренний стеклянный круг дна. Оставьте планшетки при комнатной температуре внутри шкафа биологической безопасности минимум на 30 минут. Тем временем подогрейте DMEM с 10% NCS до 37 °C на водяной бане.

После этого удалите DMEM из культурального флакона с помощью стеклянной пипетки. Затем промойте дно флакона теплым стерильным PBS, чтобы удалить остатки DMEM. Чтобы отделить культивируемые гладкомышечные клетки от дна флакона, быстро промойте флакон одним миллилитром трипсина, после чего удалите его.

Затем добавьте еще 1 мл трипсина. Аккуратно перемешайте содержимое флакона в течение 30–60 секунд, чтобы фермент соприкоснулся со всем дном флакона, прежде чем вынуть его. После того как клетки будут отделены с помощью трипсина, добавьте во флакон свежую среду DMEM с 10% NCS, чтобы остановить действие трипсина.

Перенесите полученный клеточный раствор из колбы в чистую промаркированную коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Затем добавьте один миллилитр свежего DMEM с добавлением 10 процентов NCS в каждую подготавливаемую лунку. После этого осторожно несколько раз переверните пробирку с клеточным раствором, чтобы разбить образовавшийся осадок.

Перенесите пипеткой необходимый объем осторожно перемешанной клеточной суспензии в каждый планшет. Затем тщательно вращайте каждый планшет по часовой или против часовой стрелки, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток по стеклу на дне. Необходимо добавить в планшет достаточное количество клеток, чтобы в течение следующих 48 часов они достигли степени конфлюэнтности, достаточной для эффективной визуализации.

После добавления среды и клеточной суспензии в каждую лунку инкубируйте планшеты при 37 °C в атмосфере 5 % CO2 в течение как минимум одного часа, чтобы клетки могли надлежащим образом прикрепиться к стеклянному дну. Проверяйте планшеты под микроскопом с интервалом в пятнадцать минут до тех пор, пока клетки четко не прикрепятся. Затем извлеките аликвоту Adenavirus D1 SR из хранилища при -80 °C и перенесите ее в шкаф биологической безопасности в мобильном контейнере со льдом. Затем.

Пипеткой внесите требуемую дозу охлажденного D one SR в каждую лунку и инкубируйте инфицированные клетки при 37 °C в течение ночи. На следующий день добавьте к клеткам 1 мл свежей среды DMEM с добавлением 10% NCS. Затем инкубируйте планшеты в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO₂ в течение ночи.

После инкубации в течение ночи удалите культуральную среду из планшета. Трижды промойте культуральный планшет одним миллилитром теплого физиологического буфера HEPES-PSS. Затем, непосредственно перед записью, добавьте один миллилитр свежего теплого буфера HEPES-PSS.

Выполните первичную визуализацию с помощью приложения FRET SE, открыв соответствующее программное обеспечение конфокального микроскопа. После открытия приложения перейдите на вкладку настройки (setup), чтобы установить необходимые параметры эксперимента. Вручную измените настройки каналов таким образом, чтобы возбуждение клеток происходило последовательно на длине волны 440 нанометров для донора и FRET и на 513 нанометрах для акцептора.

Затем установите длину волны эмиссии на 488 нанометров для донора и 535 нанометров для FRET и акцептора. После этого установите интенсивность света на 15% пропускания с временем экспозиции возбуждения клеток 150 миллисекунд и интервалами между экспозициями в 10 секунд. Затем стабилизируйте планшет на предметном столике микроскопа.

Используйте кнопку live для проверки разрешения изображения. При необходимости дополнительно отрегулируйте настройки для достижения желаемого разрешения. Перейдите на вкладку setup и сделайте снимок образца, нажав кнопку capture image.

Теперь перейдите на вкладку оценки (evaluation) и выберите соответствующий метод расчета эффективности FRET для проводимых экспериментов. Для экспериментов с использованием камелеонов, таких как индикатор D1SR, рекомендуется метод три, основанный на рациометрическом расчете. После этого перейдите на вкладку графика (graph), чтобы наблюдать за регистрируемыми значениями интенсивности в виде графика.

При необходимости выделите область интереса (ROI) в окне просмотра изображения, чтобы наблюдать на графике среднюю интенсивность этой области. Начните запись для сбора данных в течение как минимум трех минут, чтобы обеспечить стабильный базовый уровень сигнала перед введением исследуемого агента. Затем введите агент, перемещающий кальций, для истощения запасов кальция в саркоплазматическом ретикулуме (SR), нанеся его непосредственно в планшет рядом с регистрируемой областью интереса.

Продолжайте запись в течение желаемого времени после воздействия. Затем с помощью конфикального инвертированного микроскопа и приложения FRET SE получите серию рациометрических FRET-изображений. На этом этапе, чтобы подготовить культуральные планшеты с гладкомышечными клетками аорты крысы, трижды промойте планшет одним миллилитром теплого физиологического буфера HEPES-PSS.

Затем смешайте индикатор с одним миллилитром теплого HEPES-PSS и нанесите его на культуральные планшеты. Инкубируйте гладкомышечные клетки с индикатором в течение одного часа при комнатной температуре. Спустя час удалите индикатор из культурального планшета и трижды промойте его одним миллилитром теплого физиологического буфера HEPES-PSS.

Затем, непосредственно перед началом записи, добавьте один миллилитр свежего теплого буфера HEPES-PSS. С помощью конфокального инвертированного микроскопа сделайте серию снимков. Впоследствии введите агент, перемещающий кальций, для истощения запасов кальция в СР, и продолжайте запись в течение необходимого времени после обработки.

Здесь представлены репрезентативные снимки гладкомышечной клетки, трансфецированной индикатором D one SR, полученные с использованием полосовых фильтров CFP, FRET и YFP. На данном рисунке показаны псевдоцветные снимки в реальном времени культивируемых гладкомышечных клеток аорты крысы, трансфецированных D one SR. Обработка 2 µM тапсигаргина привела к снижению интенсивности сигнала, что указывает на значительное падение содержания кальция в СЭП вследствие вызванного тапсигаргином высвобождения кальция. На данном графике приведена репрезентативная кривая нормированного отношения D one SR в культивируемых гладкомышечных клетках, обработанных 2 µM тапсигаргина, что подтверждает значительное снижение уровня кальция в СЭП.

Представлены репрезентативные снимки культивируемых гладкомышечных клеток аорты крысы, загруженных цитоплазматическим индикатором кальция и обработанных 2 µM тапсигаргина. Как показано, тапсигаргин вызывает значительное увеличение интенсивности сигнала в цитоплазме вследствие высвобождения кальция из саркоплазматического ретикулума (СР). На данном графике представлена репрезентативная кривая нормированного отношения Fluo-4 AM в культивируемых гладкомышечных клетках, обработанных 2 µM тапсигаргина. Изображенное увеличение сигнала кальция считается пропорциональным количеству кальция, высвобожденного из СР. После освоения эта методика может быть выполнена примерно за 48 часов от начала до конца при условии правильного проведения всех этапов.

При выполнении данной процедуры важно поддерживать клетки в описанных условиях, чтобы обеспечить их жизнеспособность перед трансфекцией индикатором кальция. После просмотра этого видео вы должны четко понимать, как подготовить культивируемые клетки для измерения уровней кальция в просвете СР с использованием индикатора D one SR.