Внеклеточной Запись нейрональной активности в сочетании с микроионофоретическое Применение нейроактивный веществ у бодрствующих мышей

Общая цель этой процедуры заключается в манипулировании воздействием синаптических входов нейронного процессинга с помощью микроионтофоретических инъекций нейроактивных веществ у бодрствующих животных. Этот метод может помочь распутать ключевые функциональные возможности с помощью сенсорных систем, такие как роль нейротрансмиттеров и их взаимодействие на сенсорные стимулы и кодирование. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет манипулировать локальными динамическими входами в язычок и изучать нейрональные модулирующие системы, не подвергаясь воздействию анестезии.

Хотя этот блудный сын был здесь у сдержанных мышей, его также можно использовать у других млекопитающих, таких как летучие мыши, крысы или морские свинки. Чтобы начать эту процедуру, поместите вольфрамовую проволоку в специально изготовленный инструмент для выравнивания для резки. Аккуратно прикрепите свободные концы проводов с помощью скотча и обрежьте их до нужной длины.

Далее аккуратно потяните за ленту для того, чтобы снять вольфрамовые провода с юстировочного инструмента. Следим за тем, чтобы все провода оставались прикрепленными к ленте. Затем накатайте ленту на шпиндель из полированной латуни и крепко прижмите провода к шпинделю, чтобы было хорошее электрическое соединение.

После этого подключите шпиндель к двигателю со скоростью вращения 5 об/мин на рабочей станции. Доступ к шпинделю расположен под углом 45 градусов относительно поверхности травильного раствора. Впоследствии погрузите в раствор одну треть проводов.

Затем погрузите электрод из угольного стержня в ванну для травления, чтобы замкнуть цепь. Включите рабочую станцию, чтобы шпиндель начал вращаться, затем отрегулируйте ток, проходящий через электроды и травильный раствор, до 250 миллиампер. Прекратите травление наконечника, когда ток упадет до 200 миллиампер, чтобы протравить наконечники провода в очень тонкие точки.

Теперь поместите проволоку в капилляр из боросиликатного стекла так, чтобы его нижний конец был заблокирован пластилином. Удерживайте пипетку с помощью нагревательной спирали и подвешенного поршня. Закрепите покрытый стеклом провод на предметном стекле, прежде чем поместить его под микроскоп.

Установите кончик и коснитесь борной бусины в фокусе. Затем нагрейте бусину, пока она слегка не растает. После этого вставьте примерно от 10 до 15 микрон наконечник провода и выключите потенциометры нагрева.

Когда шарик остынет, снимите стекло с кончика электрода, чтобы обнажить вольфрам. Чтобы получить наконечник около 15 миллиметров, установите полярик на соответствующие параметры. Потяните за капилляр, чтобы получить две пипетки с уединенным наконечником.

Закрепите пильный пипетку на предметном стекле с помощью пластилина и сломайте его кончик тонкими ножницами, щипцами или плоской стороной скальпеля. Слегка отрегулируйте угол между электродом и многоствольным станком, чтобы получить лучшее сцепление и более тонкий ансамбль. Под микроскопом тщательно выровняйте вольфрамовый электрод над многоствольным наконечником.

После выравнивания опустите электрод до тех пор, пока он не соприкоснется с многоцилиндровым станком. Установив канавку между двумя верхними барабанами, затем сдвиньте кончик электрода так, чтобы он выступал на 15-20 микрометров от кончика многоцилиндрового цилиндра. Теперь нанесите небольшую каплю легкоотверждаемого клея на вольфрам и многоствольный ансамбль на расстоянии около 5 миллиметров от их кончиков.

Не допускайте попадания клея на кончики, чтобы избежать блокировки многоствольных каналов, и отверждайте клей с помощью светодиодной лампы синего света Теперь поместите животное под наркозом на одеяло с подогревом, чтобы поддерживать его температуру на уровне 38 градусов по Цельсию, и стабилизируйте голову животного в стереотаксической рамке с двумя ушными планками и прикусочной планкой Затем нанесите офтальмологический гель для защиты глаз. Далее побрейте кожу головы и нанесите повидон-йод для дезинфекции кожи. С помощью скальпеля сделайте разрез по средней линии, чтобы обнажить череп и втянуть перистиум, охватывающий перидальную и более ростральную часть затылочных костей.

Затем нанесите тонкий слой легкоотверждаемого клея на череп и основание головного столба. Подождите 10 секунд и поместите головной столб на ростральную область теменных костей по средней линии. Используйте источник синего света для отверждения клея в течение 20 секунд для эффективной прочности сцепления.

Впоследствии просверлите два отверстия вокруг и позади основания головного столба с помощью небольшого сверла. Поместите винт для часов в просверленное отверстие, чтобы он служил дополнительной точкой контакта между черепом и сценой для головы. Сделайте полтора оборота, чтобы плотно прилегать к винтам, и проверьте щипцами, чтобы убедиться, что они не ослаблены.

Затем вставьте кончик серебряного заземляющего провода в третье отверстие и убедитесь, что он соприкасается с твердой мозговой оболочкой. Нанесите небольшую каплю водостойкого цианоакрилатного клея, чтобы привязать проволоку к черепу. После этого нанесите светоотверждаемый композит, чтобы укрепить соединение головного столба с черепом, покрыв основание головного столба, нижнюю часть серебряной проволоки и винты.

Будьте осторожны, чтобы не выходить за пределы лямбда-выражения, чтобы обеспечить доступ во время записи и отверждение композита с помощью синего источника света. Затем втяните мышцу в задней части шеи в месте ее вставки на черепе. Используя небольшой трепан, просверлите круглое окно чуть ниже лямбда-шва и сбоку к средней линии, чтобы обнажить нижний колликулус.

Во время этой процедуры поместите тело животного в изготовленный на заказ мягкий удерживатель из пенопласта. Закрепите оголовок на держателе, прикрепленном к стереотаксической раме. Это хорошее время, чтобы дать животному жидкое вознаграждение.

Далее накройте тело животного хлопчатобумажным одеялом и неплотно закрепите его с помощью пластикового полуцилиндра и скотча. С помощью шприца с гибким наконечником наполните бочки выбранными препаратами. С помощью микроманипулятора поместите многоствольный электрод на его держатель.

Затем поместите некодированную серебряную проволоку внутрь каждой бочки так, чтобы один конец соприкасался с раствором, а другой конец был доступен. Затем подключите эти концы к устройству микроионофореза. После этого соедините положительную клемму с торцом вольфрамового электрода, а клемму заземления — с серебряным проводом, который контактирует с твердой мозговой оболочкой.

Впоследствии перемещайте многоствольный электрод до тех пор, пока наконечник не соприкоснется с поверхностью мозга. Применяйте теплый стерильный физиологический раствор, чтобы предотвратить высыхание тканей мозга. В этот момент подайте ток удержания, чтобы избежать утечки лекарства из наконечника цилиндра при поиске активности одного блока.

Запись нейронной активности и ионтофоретического применения габазина. Здесь показана область частотной характеристики четырех зарегистрированных нейронов в нижней части холмика до и во время микроионтофоретической инъекции габазина. Черные крестики указывают на то, что частоты выбраны для представления в виде редких и повторяющихся звуков.

Здесь представлены накопленные перистимульные временные гистограммы нейронного ответа на все частоты и интенсивности, представленные для построения области ответа до и во время инъекции габазина. Черные полосы указывают на длительность звука. Вот точечные растры спайкового отклика на пару частот, представленные красным цветом как редкие, и повторяющиеся стимулы синим цветом до и во время применения габазина.

Затемненный фон указывает на продолжительность раздражителя. Эти точечные растры показывают отклики при переключении относительных вероятностей парачастот. На этом графике показаны реакции отдельных нейронов на семь пар частот, представленные в виде редкого и повторяющегося звука до и во время применения габазина.

На этом графике показаны индексы SSA нейронного ответа на редкие и повторяющиеся звуки, измеренные до и во время применения габазина. После освоения описанной процедуры можно регулировать конкретные параметры в соответствии со структурой и типом интересующего нейрона. При попытке записи животных с помощью подголовника важно помнить, что время записи определяется и ограничивается уровнем привыкания животного, но важным преимуществом является то, что несколько разрезов могут быть выполнены на одном и том же животном в течение нескольких дней, что сводит к минимуму количество используемых животных.

Выполняя микроионтофоретическую терапию с использованием задних электродов, можно комбинировать другие процедуры, такие как инъекции нейронных транзисторов, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как источник входных данных и цель проекции нейронов в месте записи. Критическим вопросом при работе с бодрствующими животными является их благополучие, поэтому никогда не превышайте количество времени вызова, утвержденное в вашем протоколе, и, пожалуйста, постоянно контролируйте, чтобы проверить любые признаки дискомфорта. Если это так, необходимо немедленно прекратить запись.