Внеклеточной Запись нейрональной активности в сочетании с микроионофоретическое Применение нейроактивный веществ у бодрствующих мышей

Общая цель данной процедуры заключается в манипулировании влиянием синаптических входов на нейронную обработку с помощью микроионофоретического введения нейроактивных веществ бодрствующим животным. Этот метод позволяет выявить ключевые функциональные особенности сенсорных систем, такие как роль нейромедиаторов и их взаимодействие при воздействии сенсорных стимулов и кодировании. Основным преимуществом данной техники является возможность манипулирования локальными синаптическими входами в область tab и изучения нейронных модулирующих систем без влияния анестезии.

Хотя данный протокол был реализован на фиксированных мышах, он также может быть использован для других млекопитающих, таких как летучие мыши, крысы или морские свинки. Для начала процедуры поместите вольфрамовые проволоки в специально изготовленный инструмент для выравнивания и резки. Осторожно закрепите свободные концы проволок с помощью клейкой ленты и обрежьте их до нужной длины.

Затем аккуратно потяните ленту, чтобы извлечь вольфрамовые проволоки из устройства для выравнивания. Убедитесь, что все проволоки остаются прикрепленными к ленте. Затем намотайте ленту на полированный латунный шпиндель и плотно прижмите проволоки к шпинделю для обеспечения надежного электрического контакта.

После этого подсоедините шпиндель к двигателю с частотой вращения 5 RPM на рабочей станции. Шпиндель расположен под углом 45 градусов относительно поверхности раствора для травления. Затем погрузите одну треть проволок в раствор.

Затем погрузите угольный стержневой электрод в травильную ванну для замыкания цепи. Включите рабочую станцию, чтобы шпиндель начал вращаться, после чего установите силу тока, проходящего через электроды и травильный раствор, на 250 milliamps. Прекратите травление кончиков, когда сила тока упадет до 200 milliamps, чтобы придать кончикам проволоки форму очень тонких игл.

Теперь вставьте проволоку в боросиликатный стеклянный капилляр, нижний конец которого заблокирован модельной глиной. Удерживайте пипетку с помощью нагревательной спирали и подвесного плунжера. Закрепите проволоку в стеклянной оболочке на предметном стекле, прежде чем поместить ее под микроскоп.

Настройте окуляр и сфокусируйтесь на борном шарике. Затем нагревайте шарик до его частичного плавления. После этого введите кончик проволоки примерно на 10–15 микрон и выключите потенциометры нагрева.

По мере остывания шарика снимите стекло с кончика электрода, чтобы обнажить вольфрам. Чтобы получить кончик длиной около 15 миллиметров, установите соответствующие параметры пуллера. Вытяните капилляр, чтобы получить две пипетки с изолированным кончиком.

Закрепите капиллярную пипетку на предметном стекле с помощью моделирующего пластилина и отломите ее кончик, используя тонкие ножницы, пинцет или плоскую сторону скальпеля. Слегка отрегулируйте угол между электродом и многоканальным наконечником, чтобы добиться лучшего прилегания и более тонкого соединения. Под микроскопом аккуратно совместите вольфрамовый электрод с кончиком многоканального наконечника.

После выравнивания опустите электрод до контакта с многоканальным стволом. Поместив его в паз между двумя верхними стволами, сдвиньте кончик электрода так, чтобы он выступал на 15–20 micrometers за кончик многоканального ствола. Теперь нанесите небольшую каплю светоотверждаемого адгезива на вольфрамовый электрод и многоканальный ствол примерно в 5 millimeters от их кончиков.

Следите за тем, чтобы клей не попал на кончики, чтобы избежать закупоривания каналов многоканального дозатора, и отвердите клей с помощью синего светодиодного LED-светоизлучателя. Теперь поместите анестезированное животное на греющий коврик для поддержания температуры тела на уровне 38 °C и зафиксируйте голову животного в стереотаксической раме с помощью двух ушных и одного прикусного зажимов. Затем нанесите офтальмологический гель для защиты глаз. Далее выбрейте шерсть на скальпе и обработайте кожу повидон-йодом для дезинфекции. С помощью скальпеля сделайте разрез по срединной линии, чтобы обнажить череп, и отодвиньте надкостницу, покрывающую теменную и более ростральную часть затылочных костей.

Затем нанесите тонкий слой светоотверждаемого адгезива на череп и основание головного штифта. Подождите 10 секунд и установите головной штифт над ростральной областью теменных костей по срединной линии. Используйте источник синего света для полимеризации адгезива в течение 20 секунд для обеспечения достаточной прочности соединения.

Затем с помощью сверла с малым диаметром просверлите два отверстия вокруг и позади основания стойки для головы. Вставьте в просверленное отверстие часовой винт, который будет служить дополнительной точкой контакта между черепом и головным стейджем. Сделайте один с половиной оборота, чтобы плотно зафиксировать винты, и проверьте их пинцетом, чтобы убедиться, что они не разболтались.

Затем вставьте конец серебряного заземляющего провода в третье отверстие и убедитесь, что он касается твердой мозговой оболочки. Нанесите небольшую каплю водостойкого цианоакрилатного клея, чтобы закрепить провод на черепе. После этого нанесите светоотверждаемый композит, чтобы усилить соединение головного крепления с черепом, покрыв основание крепления, нижнюю часть серебряного провода и винты.

Следите за тем, чтобы разрез не выходил за пределы лямбды, чтобы обеспечить доступ во время записи, и полимеризуйте композит с помощью источника синего света. Затем отведите мышцу в задней части шеи рядом с ее прикреплением к черепу. С помощью небольшого трепана просверлите круглое окно чуть ниже лямбда-шва и латеральнее срединной линии, чтобы обнажить нижние холмики.

В данной процедуре поместите тело животного в специально изготовленный фиксатор с пенопластовыми подушками. Закрепите головной штифт в держателе, прикрепленном к стереотаксической раме. Это подходящий момент, чтобы дать животному жидкое вознаграждение.

Затем накройте тело животного хлопковой салфеткой и неплотно зафиксируйте ее с помощью пластикового полуцилиндра и клейкой ленты. С помощью шприца с гибким наконечником заполните каналы выбранными препаратами. Используя микроманипулятор, установите многоканальный электрод в держатель.

Затем поместите в каждый канал немаркированную серебряную проволоку так, чтобы один её конец касался раствора, а другой оставался доступным. После этого подсоедините эти концы к устройству для микроионтофореза. Затем подключите положительный терминал к концу вольфрамового электрода, а терминал заземления — к серебряной проволоке, контактирующей с твердой мозговой оболочкой.

Затем переместите многоканальный электрод до тех пор, пока его кончик не коснется поверхности головного мозга. Наносите теплый стерильный физраствор, чтобы предотвратить высыхание тканей мозга. После этого подайте удерживающий ток, чтобы избежать утечки препарата из кончика канала при поиске активности одиночных нейронов.

Регистрация нейронной активности и ионтофоретическое введение габазина. Здесь показана область частотного отклика четырех зарегистрированных нейронов в нижнем двухолмии до и во время микроионтофоретического введения габазина. Черные крестики обозначают частоты, выбранные для предъявления в виде редких и повторяющихся звуков.

Здесь представлены накопленные перистимульные временные гистограммы нейронного ответа на все частоты и интенсивности, использованные для построения области отклика до и во время инъекции габазина. Черные полосы обозначают длительность звука. Здесь приведены растровые диаграммы спайкового ответа на пару частот, представленных в виде редкого стимула (красным цветом) и повторяющегося стимула (синим цветом) до и во время применения габазина.

Затененный фон указывает на продолжительность стимула. На данных растровых диаграммах точек показаны ответы при изменении относительных вероятностей парачастот. На этом графике представлены ответы одного нейрона на семь пар частот, предъявляемых в виде редкого и повторяющегося звуков, до и во время применения габазина.

На этом графике показаны индексы SSA нейронного ответа на редкие и повторяющиеся звуки, измеренные до и во время применения габазина. После освоения описанная процедура позволяет корректировать конкретные параметры в соответствии с нейронной структурой и типом интересующего нейрона. При записи сигналов от животных с фиксацией головы крайне важно помнить, что время записи определяется и ограничивается уровнем привыкания животного; однако важным преимуществом является то, что на одном и том же животном в течение нескольких дней можно провести несколько сессий записи, что сводит к минимуму количество используемых животных.

Использование метода микроионтофореза с помощью дополнительных («piggyback») электродов позволяет сочетать его с другими процедурами, такими как имплантация нейронных транзисторов, для получения ответов на дополнительные вопросы, например, об источнике входных сигналов и мишенях проекций нейронов в зоне регистрации. Критически важным аспектом при работе с бодрствующими животными является их благополучие, поэтому никогда не превышайте время удержания, одобренное в вашем протоколе, и постоянно следите за любыми признаками дискомфорта. В таком случае запись необходимо немедленно прекратить.