Метод к цели и изолят Airway-иннервирующих сенсорные нейроны у мышей

Общая цель данного эксперимента заключается в маркировке и изоляции узловых нейронов блуждающего нерва, иннервирующих дыхательные пути. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области периферической нейробиологии, например: какими идентифицирующими свойствами обладают нейроны, иннервирующие дыхательные пути?

Основным преимуществом данного метода является то, что он обеспечивает надежный и высокопроизводительный способ таргетинга и изоляции специфических популяций нейронов. После сбора сенсорных ганглиев аспирируйте 500 µL раствора для диссоциации ганглиев из каждой пробирки, не затрагивая сами ганглии. Затем добавьте один миллилитр PBS в каждый образец и дождитесь, пока ганглии осядут на дно пробирок.

Затем удалите PBS и добавьте к нейронам один миллилитр раствора для диссоциации ганглиев с добавлением фермента для переваривания, после чего добавьте 20 мкл Fast Blue в пробирку с положительным контролем. Инкубируйте пробирки при 37 °C в течение времени, соответствующего сроку годности фермента для переваривания. Каждые 15 минут осторожно встряхивайте и постукивайте по пробиркам, чтобы ганглии были полностью покрыты раствором для переваривания.

Пока идет процесс переваривания нервных клеток, медленно и осторожно добавьте 400 мкл свежеприготовленного раствора плотностью 12% поверх 400 мкл раствора плотностью 28% в одну пробирку объемом 1,5 мл для каждого образца. Должны стать видны два отчетливых слоя, один из которых темнее другого. Затем промаркируйте пробирки объемом 1,5 мл для сбора отсортированных клеток, включая одну пробирку для Fast Blue-положительных и одну для Fast Blue-отрицательных клеток для каждого сортируемого образца.

По окончании периода переваривания удалите фермент и промойте ганглии дважды одним миллилитром PBS, как было продемонстрировано ранее. После второго промывания добавьте в каждую пробирку 200 мкл свежего раствора для диссоциации ганглиев. Затем, используя 200-микролитровую пипетку, установленную на объем 100 мкл, несколько раз перенесите ганглии вверх и вниз, чтобы диссоциировать клетки в суспензию одиночных клеток, стараясь избегать образования пузырьков.

Если видимые фрагменты неповрежденной ткани отсутствуют, крепко удерживая в одной руке клеточный фильтр с размером пор 70 micron, перенесите пипеткой раствор диссоциированных клеток в центр фильтра. Затем промойте пробирку для диссоциации 100 microliters свежего раствора для диссоциации ганглиев, чтобы собрать оставшиеся клетки. Пропустите промывочный раствор через фильтр и с помощью нового наконечника пипетки аспирируйте весь оставшийся раствор с клетками с нижней стороны фильтра, добавив его к клеточной суспензии.

Теперь осторожно нанесите все 300 µL клеток поверх предварительно подготовленного градиента плотности. Соберите клетки ганглиев путем центрифугирования. Пока клетки центрифугируются, добавьте 300 µL свежеприготовленного лизирующего буфера в пробирку для сбора Fast Blue-положительных клеток и 600 µL лизирующего буфера в пробирку для сбора отрицательных клеток, чтобы жидкость из оболочки сортера не слишком сильно разбавила лизирующий буфер.

По окончании центрифугирования осторожно удалите верхние 700 µL раствора, содержащего основную массу клеточного детрита. Затем смешайте 700 µL свежего раствора для диссоциации ганглиев с оставшимися клетками. Осадите клетки путем центрифугирования и осторожно удалите супернатант.

Затем повторно суспендируйте клетки в 200–300 мкл раствора для диссоциации ганглиев перед сортировкой, используя пипетку на 1 000 мкл, настроенную на 200 мкл. Поместите клетки на лед до начала сортировки. После очистки клеток ганглиев методом FACS гомогенизируйте нейроны в лизирующем буфере в течение одной минуты при перемешивании на вортексе.

Затем несколько раз перемешайте клетки с равным объемом 70% этанола и перенесите до 700 µL образца в центрифужную колонку. Центрифугируйте колонку в микроцентрифуге в течение 15 секунд при 8 000 x g и удалите фильтрат. После того как весь образец пройдет через центрифужную колонку, экстрагируйте РНК в соответствии со стандартными протоколами очистки РНК.

Затем используйте систему микрофлюидного электрофореза для проверки качества РНК в соответствии со спецификациями производителя. На этих графиках показаны отрицательный и положительный контроли Fast Blue, использованные для установки гейтов сортировки. После этого диссоциированные клетки узла блуждающего нерва, меченные Fast Blue, могут быть отсортированы на популяции Fast Blue-положительных и Fast Blue-отрицательных клеток.

Эффективность сортировки при использовании данного метода составляет от 73 до 85%, при этом в среднем собирается примерно 1 500 или менее Fast Blue-положительных клеток и почти 60 000 Fast Blue-отрицательных клеток. Как видно на примере данного репрезентативного образца, пики 18S и 28S, полученные методом микрофлюидного электрофореза, могут быть затем использованы для расчета индекса целостности РНК (RNA integrity number) с целью определения качества экстрагированной РНК. При должном навыке и правильном выполнении эта процедура может быть завершена за четыре с половиной часа.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости быстрого прохождения этапов и использования свежеприготовленных растворов для экстракции РНК. После выполнения этой процедуры можно применить другие методы, такие как культивирование нейронов, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, какие функциональные свойства уникальны для нейронов, иннервирующих дыхательные пути? После разработки этот метод открыл исследователям в области периферической нейробиологии возможность изучить уникальные свойства специфической популяции нейронов, иннервирующих дыхательные пути, в узловатых ганглиях блуждающего нерва.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как маркировать и диссоциировать специфические нейроны узловатого ганглия, которые затем можно использовать для секвенирования РНК или высевать для функциональных исследований. Не забывайте, что работа с 2-меркаптоэтанолом может быть крайне опасной, и при использовании этого соединения всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как использование перчаток и работа в вытяжном шкафу.