Дифференциация мерцательной кардиомиоцитов из плюрипотентных стволовых клеток Используя BMP антагонистов Grem2

Общей целью данного протокола дифференцировки является получение однородных популяций кардиомиоцитов предсердий в культуре. Таким образом, этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в изучении развития сердца и сердечных заболеваний, таких как предсердная аритмия. Основные преимущества этого метода заключаются в том, что он позволяет получать гомогенные культуры предсердных кардиомиоцитов in vitro и что это можно сделать с минимальной тренировкой.

За четыре дня до установки эмбриональных стволовых клеток мыши или культур mESC закодируйте 10-сантиметровые тканевые чашки 5 миллилитрами 0,2%-ного раствора желатина каждая, в шести луночных планшетах по 1 миллилитру желатина на лунку в стерилизованном тканевом культуральном шкафу. В день посева удалите лишний желатиновый раствор, и добавьте 10 миллилитров среды в одну из покрытых желатином 10-сантиметровых посуд. Затем с помощью криотонгов осторожно взбейте флакон с температурой 1 умножение 10 до 6 мЭСК на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия, пока в центре флакона не останется только небольшой кристалл льда.

Высушите флакон одноразовой безворсовой салфеткой и простерилизуйте его с помощью 70% этанола. Затем поместите флакон в колпак для культуры тканей и с помощью пипетки P1000 добавьте ESC в чашку. Поместите клетки в инкубатор для увлажненных клеточных культур с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа и осторожно перемещайте планшет спереди назад и из стороны в сторону, чтобы равномерно распределить клетки.

В конце инкубации используйте светлопольный микроскоп, чтобы подтвердить прикрепление клеток. Будут наблюдаться некоторые обломки и мертвые клетки. Замените среду на 10 миллилитров свежей среды mESC, и верните клетки в инкубатор.

Когда культура сгустится на 60-70%, промойте планшет 5 миллилитрами стерильного DPBS без магния и кальция и инкубируйте клетки в 2 миллилитрах трипсина ЭДТА при 37 градусах Цельсия в течение пяти минут. Пока клетки инкубируются, отсадите избыток раствора желатина из одной новой 10-сантиметровой чашки на каждую пройденную культуру, и добавьте по 10 миллилитров среды в каждую тарелку. Затем соберите оторвавшиеся клетки центрифугированием в 15-миллилитровую пробирку, и повторно суспендируйте гранулу в 10 миллилитрах среды mESC.

В зависимости от желаемого соотношения расщепления, добавьте от 0,5 до 1 миллилитра клеточной суспензии в каждую 10-сантиметровую чашку и верните клетки в инкубатор, аккуратно распределив клетки в каждой чашке, как только что продемонстрировано. Когда пропущенные клетки на 70% слиты, отделите их с помощью трипсина ЭДТА, как показано выше, затем повторно суспендируйте суспензию одиночных клеток в 5 миллилитрах эмбриоидного тела или среды EB. Подсчитайте мЭСК и затем разведите их в соответствующем объеме среды ЭБ до конечной концентрации 2,5 умножить на 10 до 3-х клеток на миллилитр.

Затем добавьте 2 миллилитра PBS на дно одной стерильной 10-сантиметровой бактериальной чашки Петри на каждую культуру висячих капель и перелейте суспензию EB в таз для стерильного раствора. Теперь снимите крышку с одной из подготовленных посуды и с помощью многоканальной пипетки, оснащенной шестью наконечниками, аккуратно нанесите 60 20-микролитровых капель суспензии EB на внутреннюю поверхность. Аккуратно закройте чашку крышкой, стараясь не сместить свисающие капли, и поместите чашки в инкубатор для клеточных культур на два дня.

Чтобы смыть EB's, осторожно снимите крышку с висящей капли культуры и наклоните ее под углом 45 градусов. Затем с помощью серологической пипетки объемом 5 миллилитров, содержащей среду EB комнатной температуры, аккуратно смойте EB в лужу на дне крышки. Внимательно осмотрите крышку на предмет прилипших к поверхности КЭБов, затем переложите ЭБ в 6-сантиметровую чашку Петри без покрытия.

Верните БЭ в инкубатор для тканевых культур еще на два дня, ежедневно проверяя планшеты на агрегацию и прикрепление БЭ. Перед нанесением покрытий на EB замените избыток раствора желатинового покрытия в каждой лунке подготовленного шестилуночного планшета 2 миллилитрами свежеприготовленной среды для обработки Grem2 комнатной температуры. Затем с помощью пипетки P1000 объемом 100 микролитров нанесите по 30 EB в каждую лунку, затем верните планшет в инкубатор на ночь, равномерно распределяя клетки мягкими движениями, как показано на рисунке.

После того, как EB прикрепятся к дну лунок, заменяйте среду Grem2 каждые два дня до 10-го дня. Затем каждые два дня кормите клетки свежей средой EB для поддержания здоровой клеточной культуры. Перед культивированием висячих капель плюрипотентные стволовые клетки должны быть компактными и свободными от спонтанной дифференцировки.

Если наблюдается спонтанная дифференцировка, клетки не следует использовать в культурах висячих капель. Качественный EB, как правило, лучше всего формируется в равномерно расположенных, хорошо закругленных висячих каплях. Ко второму дню дифференцировки БЭ должны быть видны невооруженным глазом в виде сферических расположений дифференцирующих стволовых клеток на кончиках висячих капель.

На четвертый день хорошо сформированные БЭ должны быть свободно плавающими и однородными по размеру и форме. После нанесения БЭ будут сплющиваться по мере того, как клетки мигрируют из БЭ на поверхность тканевой культуральной пластины, как это наблюдалось здесь на восьмой и 10-й дни дифференцировки. В необработанных контрольных скважинах небольшие, медленно сокращающиеся участки наблюдаются уже на шестой день и до девятого дня.

В то время как в скважинах, обработанных Grem2, часто встречаются большие участки с относительно быстрой скоростью сжатия. Анализ экспрессии генов в дифференцированных клетках методом ОТ-КПЦР обычно выявляет высокие уровни структурных и регуляторных генов сердца в культурах, обработанных Grem2. При использовании нуковой клеточной линии альфа-MHC DsRed увеличение выхода кардиомиоцитов наблюдается при увеличении количества меченых DsRed ядер в лунках, обработанных Grem2.

Лечение Grem2 также смещает дифференцировку в сторону предсердного фенотипа, что подтверждается измерениями ОТ-КПЦР и пластырного зажима длительности потенциала клеточного действия. После освоения дифференцирующие стволовые клетки можно обрабатывать Grem2 всего за 60 минут, а гранулирование обычно наблюдается уже на седьмой день. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о постоянном добавлении Grem2 на четвертый день после пиковой экспрессии маркеров гаструляции, таких как брахюры.

После этой процедуры могут быть применены другие методы, такие как электрофизиология и КПЦР, чтобы понять функциональные и молекулярные характеристики полученных клеток. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как получить предсердные кардиомиоциты из ESC мышей с помощью Grem2.