Использование ламинирование Методика Выполните конфокальной микроскопией Человеческой склеры

Общая цель данной методики заключается в проведении конфокальной микроскопии склеры человека. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в офтальмологической сфере. Например, распределение иммунных клеток и состояние сосудов у здоровых людей, а также патологические состояния у склер.

Основным преимуществом этой методики является то, что она позволяет проводить конфокальную визуализацию плотной соединительной ткани. Демонстрировать процедуру будет Стефан Кремерс, аспирант нашей лаборатории. Для начала приготовьте 96 процентов этанола и PBS в отдельных пробирках.

Затем приготовьте по 100 микролитров на пробу первичных антител в рекомендуемом разведении PBS, содержащем двухпроцентный BSA, и держите все растворы на льду. Разложите чистые инструменты, в том числе один-два щипца Colibri, прямые микроножницы для препарирования, изогнутые ножницы, скальпель номер 10 или микроперо офтальмологического скальпеля, четыре иглы 26 калибра и тампон. Оберните алюминиевую фольгу вокруг полистирольной пластины, или подготовьте пробковую пластину для крепления ткани.

После того, как луковица открылась спереди в соответствии с текстовым протоколом, поместите склеру на тампон открытой частью вверх. Затем с помощью щипцов колибри удалите сетчатку и пигментированные увеальные слои из внутренней склеры до тех пор, пока склера не освободится от этих слоев. Далее используйте изогнутые ножницы, если необходимо удалить сетчатку и язычок из сосочка.

Затем удалите оставшуюся конъюнктиву, экстраовулярные мышцы и капсулу с сухожилиями из поверхностной склеры. Теперь, используя щипцы колибри для мягкого удержания ткани, прямыми ножницами отрежьте примерно два квадратных сантиметра склеральных образцов из разных мест на ткани, избегая повторного захвата щипцами, что сделает область непригодной для конфокальной микроскопии. Поместите образцы в пробирки объемом 1,5 миллилитров, добавьте 1,5 миллилитра 96-процентного этанола и инкубируйте в течение 15 минут, чтобы зафиксировать ткань.

Затем, удалив этанол, используйте 1,5 миллилитра PBS для промывки образцов три раза по пять минут каждый, встряхивая. Затем перенесите образцы в 1,5 миллилитра PBS с пятью процентами BSA и инкубируйте при комнатной температуре в течение двух часов, что вызовет набухание образцов, чтобы помочь ламинированию и предотвратить неспецифическое связывание. Когда образцы набухли, под стереобинокулярным микроскопом используйте изогнутые по краям иглы 26 калибра, чтобы прикрепить задние склеральные образцы к обернутой фольгой полистирольной мембране или пробковой пластине.

Затем для ламинирования образцов на всю толщину используйте щипцы колибри, чтобы горизонтально удерживать передний край склеральной ткани. Скальпелем под номером 10 аккуратно срезайте как можно тоньше слой поверхностной склеры, от нижележащего слоя. Чтобы ткани не пересыхали, нанесите пипеткой 50 микролитров PBS на слои.

Затем, после того, как слои будут срезаны, поместите их в 100 микролитров PBS в 96-луночную пластину и используйте водостойкий маркер, чтобы обозначить как ориентацию, так и слой. Продолжайте изолировать слои и переносите на 96-луночный планшет до тех пор, пока ткань не будет полностью ламинирована. Для проведения иммуногистохимии удалите среду из 96-луночного планшета, прижав пипетку к стенке каждой лунки и отасунув жидкость.

Затем добавьте 100 микролитров первичных антител, разведенных один к 100 в PBS с двухпроцентным BSA в соответствующие лунки, и инкубируйте при четырех градусах Цельсия в течение ночи. На следующий день используйте от 200 до 300 микролитров PBS, чтобы промыть образцы на шейкере три раза по пять минут каждый. При необходимости используйте другое первичное антитело и снова инкубируйте в течение ночи при четырех градусах Цельсия.

Затем добавьте 100 микролитров соответствующих вторичных антител, разведенных один к 300 в PBS с двухпроцентной козьей сывороткой, и инкубируйте в темноте при комнатной температуре в течение одного-двух часов. После инкубации используйте от 200 до 300 микролитров PBS, чтобы снова промыть образцы на шейкере три раза по пять минут каждый. Затем добавьте в каждую лунку по 100 микролитров раствора один к 2000 DAPI и выдержите в темноте при комнатной температуре.

Перед использованием от 200 до 300 микролитров PBS промыть образцы два раза. Перенесите образцы на предметные стекла микроскопа под стереобинокулярный микроскоп, чтобы убедиться, что образец лежит на предметном стекле, и добавьте одну-две капли флуоресцентной монтажной среды. Затем положите сверху чехол и используйте прозрачный лак для ногтей, чтобы запечатать края.

Хранить в темноте при температуре четыре градуса Цельсия для последующего использования или непосредственно с помощью конфокальной микроскопии. Для проверки толщины образцов берут z-стеки, так как толщина различается в экваториальном и кзаднем направлениях в зависимости от склерального расположения. Эти изображения показывают разнообразную сеть кровеносных сосудов в слоистой склере человека, полученной из передней и задней эписклеры.

Кровеносные сосуды положительны на CD31, как показано зеленым цветом. На этом рисунке показаны LYVE1-положительные иммунные клетки эписклеры и их связь с CD31-положительными кровеносными сосудами. Серия z-стека была взята при 10-кратном увеличении для изучения трехмерных отношений кровеносных сосудов и иммунных клеток.

Как показано здесь, экстраокулярные мышцы, заключенные в склеру, также могут быть проанализированы на наличие кровеносных сосудов или иммунных клеток с использованием маркеров CD31 и LYVE1 соответственно. После освоения техники ламинирования ее можно выполнить менее чем за час, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что ткань не должна высыхать.

Не забывайте, что работа с человеческими тканями может быть потенциально заразной, и всегда следует заранее принимать меры предосторожности, такие как микробиологическая и вирусологическая диагностика.